• 扩增子测序:物种多样性、样本差异分析

    扩增子测序:以特定环境(土壤、水体、肠道等)中微生物群落作为研究对象,通过提取环境中微生物群落的总DNA,选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的目标区域,利用高通量测序,进行生物信息学分析。可用于:

    研究环境微生物的群落结构,估计物种丰度,比较不同处理间的差异物种。

     

  • 结果展示

    物种丰度估计

    将测序序列与已知物种序列数据库比对,统计比对上序列的物种分布。也可以提取测序序列中的16sDNA序列,比对16sDNA数据库,统计物种信息。

    α多样性统计

    α多样性用于描述样品内的物种的多样性情况,包括物种的丰富度,以及物种数目的均匀度。

    主坐标分析

    PCoA,principal co-ordinates analysis)

    PCoA分析,是一种数据降维分析方法,可用来研究样本群落组成的相似性或差异性。应用PCoA分析,可以提取样品间最大差异的两个坐标轴,将多维数据反映到二维坐标上。如果样品的群落组成越相近,在图中相距越近。

    LEfSe分析

    LEfSe使用非参数因子克鲁斯卡尔—沃利斯(non-parametric factorial Kruskal-Wallis sum-rank test)和秩验检检测具有显著丰度差异特征,并找到与丰度有显著性差异的类群。最后,LEfSe采用线性判别分析(LDA)来估算每个组分丰度对差异效果影响的大小。

    统计检验组间物种差异分析

    检测处理间,显著差异的物种类群。

  • 常见问题

    1 扩增子测序与宏基因组测序有什么区别?

    扩增子测序(微生物多样性测序),是通过16S rDNA/18S rDNA/ITS功能基因的特定区段PCR产物进行高通量测序,可以获知样品中微生物的组成和丰度。宏基因组测序,通过提取环境中全部微生物的DNA测序,除了可以获知样品中微生物的组成和丰度,还可以研究环境微生物的基因组成及功能、代谢,发掘特异功能的基因等等。

    2 每个样本应该测多少数据量,多少重复?

    推荐大于5万的tag。如果需要做样品间的比较分析,推荐大于3个组内重复,对于个体差异大的样本,如动物粪便,推荐大于10个组内重复。

    3 16S rDNA/18S rDNA/ITS,怎么选择扩增序列?

    扩增子主要分为16S、18S、ITS测序,研究细菌多样性选择扩增16S序列,真菌优先选择ITS序列,研究环境中真核微生物的多样性选择18S。

  • 参考案例

    玉米根部简化和具有代表性的微生物群落

    文献名称:Simplified and representative bacterial community of maize roots

    发表期刊:PNAS

    发表时间:2016年9月

    影响因子:9.423

    研究概述

    与植物相关的微生物对其宿主的生长和健康至关重要。以前研究的结果显示,宿主基因型和非生物因子影响植物微生物组成。然而,这些微生物群落的高度复杂性对研究微生物群落的构成,微生物对植物宿主的影响是一个挑战。在这项工作中,作者得到了一个大大简化的人工合成细菌群落,由七种菌株(Enterobacter cloacae, Stenotrophomonas maltophilia, Ochrobactrum pituitosum, Herbaspirillum frisingense, Pseudomonas putida, Curtobacterium pusillum, and Chryseobacterium indologenes)构成,代表在玉米根中发现的四个最主要的门中的三个。通过使用选择性培养依赖的方法来跟踪每个菌株的丰度,作者调查了不同群落组成对玉米幼苗根的作用。只有去除E. cloacae导致合成人工菌落的完全丧失,被C. pusillum取代。这个结果表明,E.cloacae在这个模式生态系统中起着关键物种的作用。在植物和体外,这个人工合成细菌群落抑制植物病原真菌镰刀菌(Fusarium verticillioides)的生长,对宿主表现出明显的益处。因此,结合选择性培养依赖性定量方法,代表根微生物群的合成七物种群体有可能作为一种有用的系统来探索细菌种间相互作用,并可以研究微生物群落对宿主的作用。

    NaCl容液处理

    方案设计

    1. 取玉米根部,根际,土壤样本,检测细菌群落。
    2. 单克隆玉米根部细菌,鉴定物种,模拟环境中细菌群落组成,选取代表菌株,侵染无菌培养的玉米根,并检测侵染后细菌群落组成,最后选取代表菌株构建人工微生物群落。
    3. 剔除人工微生物群落中的一种菌株,侵染无菌培养的玉米根,检测侵染后菌落的组成。
    4. 用致病真菌F. verticillioides侵染有人工微生物群落和无菌培养的玉米根,观察真菌感染情况。

    研究结果

    1. 玉米根部会富集变形菌门一些特定属的微生物,暗示玉米根会富集一些属的微生物,并选择性抑制一些微生物(图A)。
    2. 选取代表菌株侵染玉米根,检测侵染后的菌落分布,发现Enterobacter属丰度优势明显,选取了具有代表性的7个菌株,作为人工微生物群落。
    3. 剔除人工微生物群落中的一种菌株,侵染无菌培养的玉米根,发现去除其他6中菌株,人工微生物群落结构能维持。而去除E. cloacae菌株,导致合成人工菌落的结构丧失,只剩下C. pusillum(图B、C)。
    4. 存在人工微生物群落的玉米根,可以抵抗真菌Fusarium verticillioides的侵染(图D)。