• GBS

    GBS(Genotyping-by-Sequencing)是一种常见的简化基因组测序技术,其原理是将基因组DNA进行酶切,然后对酶切片段两端序列进行高通量测序。GBS技术可以根据研究目的灵活调整所需捕获酶切位点的片段数(Tags),从而控制捕获序列的范围。简化基因组技术由于只对酶切片段进行测序,可极大的降低基因组的复杂度,并且不受参考基因组的限制,无参考基因组的物种也可以使用该技术进行分子标记鉴定与开发,因此该技术在群体遗传分析领域应用广泛。

  • GBS用于群体进化研究的技术优势

    不受参考基因组限制,有无参考基因组均可;

    可降低基因组的复杂度,适合基因组较大的物种;

    操作简便,周期短;


    降低成本,尤其适用于大量样本的研究。

  • 常见问题

    1 GBS Tag 的定义?

    1个Tag指酶切位点旁一条测序reads长度的序列,GBS捕获基因组的范围=Tag 数量 x 单条read 的长度。例如:以Hiseq 4000 PE150测序计算。每个样本平均10万Tag x 150bp/Tag=100000 x 150=15 M。每个样本平均10x/Tag,则每个样本测序数据量=15M x 10=150 M。

    2 如何选择Tag数和数据量?

    不同的研究目的,所需的标记数量并不完全一样。如全基因组关联分析,可能需要上万个高密度的分子标记,而系统发育关系、连锁分析等研究的分子标记密度则不需要那么高,一般只需要几百到几千个分子标记足以完成分析。因此,可先评估研究所需的标记数,再选择合适的Tag数。大多数物种推荐500Mb数据,一方面是500Mb数据适合大多数物种,另外随着测序仪测序通量的提高,测序变得便宜。不是基因组特别大的物种都建议500Mb数据。

    3 GBS能否用于无参物种?

    无参物种可以通过GBS测序和信息分析获得SNP标记,进行群体进化分析。但无参物种缺少注释信息,通常无法获得候选基因。若需要进行QTL定位、关联分析或者挖掘驯化性状相关的基因,建议使用有参物种。

    4 GBS测序质量?

    GBS测序数据质量与实验技术是否稳定有关。通常,GBS测序数据质量与全基因组文库一样,也能达到较高的数据质量(Q20≥90%,Q30≥85%)。

    5 GBS单酶切与双酶切或者多酶切的区别?

    通常情况下,GBS特指康奈尔大学开发的GBS技术,即经典的单酶GBS,该方法至今已有上千次引用率。近几年出现的双酶GBS或者多酶GBS与单酶GBS在实验细节上有些许区别,但最终目的都是为了定制Tag数量。双酶切可以得到较多的Tag数据,同时实验技术成熟,因此推荐使用双酶切。

    6 GBS是否适用于物种间的研究?

    GBS是通过酶对基因组进行捕获,通过捕获的序列,开发SNP标记,进而开展遗传连锁分析或者群体遗传学分析。若样本之间的差异太大,容易造成GBS捕获的酶切片段在样本之间不均一,共有SNP少。因此,多数情况下,GBS更适用于种以下水平的研究。也有少数情况下,同一个属的不同物种间亲缘关系很近,样本间差异小,可以采用GBS进行系统发育研究。

  • 参考案例1

    北美云杉GBS群体进化分析案例分享

    文献名称:Long-distance pollen dispersal during recent colonization favors a rapid but partial recovery of genetic diversity in Picea sitchensis

    发表期刊:New Phytologist

    影响影子:7.2

    研究背景

    北半球的树种目前正受到迅速的人为气候变化的影响,它们的分布范围也随之改变。这就提出了一个问题:当树木种群在新区域定植时,它们是如何对选择压力做出快速反应的。北美一种广泛分布的针叶树Picea sitchensis是太平洋沿岸森林的主要组成部分。它通常活到500岁左右,而特殊的树可以活到750岁。关注Picea sitchensis的北部扩张边缘,可以探讨在物种扩张时期遗传结构和多样性是如何发展的,并评估了群体历史在形成既定种群进化轨迹中的作用。

  • 研究材料

    在2013年和2015年,选取了15个采样点,共计639个样本,居群内样本数为12-86个。

    NaCl容液处理

    主要研究结果

    1)研究长寿生物(如温带树种)的进化是一项挑战,因为它们的世代通常很长。本研究,通过对树龄的估算,准确地重建了不同时期的定植群体,为群体遗传结构及遗传历史的研究提供了条件。树龄显示Seward区域树最古老,树龄向分布区域扩张边缘有递减趋势,但在局部范围内,该模式被打破。

    2)群体遗传结构和遗传多样性分析显示,P. sitchensis表现出中等水平的群体分化,Seward区域与其他区域有明显的分化。当K=2和K=3时,Shuyak Island 和Port Chatham显示出混合的血统,表明把群岛和大陆分开的海峡,目前没有产生任何明显的分化模式。等位基因丰度和期望杂合度估计显示,扩张前沿的遗传多样性呈下降趋势,但大陆居群Port Chatham的遗传多样性低于群岛区域,表明群岛居群与其他本区域以外的居群存在联系,可能得益于外来花粉的基因交流。

  • NaCl容液处理

    3)为了确定现在的区域居群结构模式是如何演变的,本研究分析了400年来Kodiak Archipelago和Seward的居群分化FST,结果显示FST没有显著的变化,可能与树木长寿命有关;此外,等位基因积累曲线表明,数据中存在的大多数等位基因都是在18世纪早期和中期获得的,表明在定植的初期,繁殖个体的低密度有利于外来基因流进入,这对这一时期遗传多样性的恢复产生了积极的影响。P. sitchensis中风媒花粉更倾向于长距离的传播,所以外源花粉流而不是种子流是导致等位基因多样性增加的原因。

    4)预期杂合度He和纬度及平均冠龄均没有显著的相关性,群体扩张前沿,遗传多样性并未减小;群岛采样点间的分化系数非常低(<0.1),与在Seward采样点之间的分化系数相似,表明遗传扩张并没有导致景观上的遗传片段化。不同采样点间差异度分析显示,1710年采样点之间的差异明显高于随后几个世纪,表明居群定植后的基因流阻止了最初的遗传片段化的继续。由外来花粉流向本地花粉流的转变,使扩张区域的前部遗传结构发生了均质化。

  • 参考案例2

    石蝇GBS群体进化分析案例分享

    文献名称:Ecological gradients drive insect wing loss and speciation: The role of the alpine treeline

    发表期刊:Molecular Ecology

    影响影子:5.8

    研究背景

    4亿年前的飞行进化被认为是以昆虫惊人的生态多样性为基础的,然而,随后几乎所有的有翅的昆虫目都出现了翅膀损失(缩小)。虽然这种翅膀的缩小消除了昆虫飞行的优势,但最近的研究表明,翅膀的缩小可以增加物种分化的速度。此外,虽然许多昆虫类群表现出翅膀长度多态性,但这种多样性的生态驱动因素仍不清楚。

    新西兰广泛分布的石蝇(Zelandoperla fenestrata)复合群表现出种内翅膀长度的多态现象,为理解生态驱动力和翅膀缩小的进化提供了理想的系统。其全翅生态型在低海拔地区尤其常见,而残翅的生态型则与高山栖息地有关。最近的基因组研究表明,残翅生态型可能通过一个或几个位点的选择而反复进化,但支撑这种明显趋同进化的因素仍不清楚。

  • 研究材料

    在两条平行的溪流(Lug Creek, Six Mile Creek)区域,共采集到166个石蝇Zelandoperla fenestrata复合群样本,两条河相隔2公里,样本采集点之间高度相隔100-200m。312个博物馆收藏标本。

    NaCl容液处理

    主要研究结果

    1)小尺度生态分析:来自于相邻高山溪流区域石蝇Zelandoperla fenestrata的平行高度样带揭示了独立的生态群,全翅生态型分布于低海拔区域,残翅生态型分布于高海拔区域。在每条溪流的高山林线(580-620m,高山草甸取代乔木)区域,全翅和残翅两种生态型发生了迅速的转变。林线上方存在狭窄的生态型重叠区。

    2)分化系数FST研究显示每条溪流的全翅和残翅生态型都存在大量的遗传分化;两条溪流的全翅居群存在很小的分化(FST = 0.012),但残翅居群的分化较大(FST = 0.297),同一溪流的残翅和全翅两种生态型的分化平均为FST = 0.184,来自于两条溪流的残翅居群在基因组上存在高度的差异,但都与其相关的全翅居群具有更近的遗传关系,表明两条溪流的残翅事件是独立发生的。STRUCTURE和PCA都显示出同样的结果,每条溪流的两个生态型分成两个组分;同时,林线上下存在狭窄的杂交区域,研究发现是F1 和 F2杂交个体。研究表明,自然选择可以促进野生种群的局部适应以及在小尺度上驱动分化,即使存在持续的基因流。

  • NaCl容液处理

    3)分子和形态学研究均发现渐变区。Six Mile溪流的渐变区宽度约为343米(基于分子数据为284米);Lug 溪流的渐变区宽度约为260米。两条溪流样本的平均杂合度没有显著差异,Lug 溪流中杂交样本的杂合度显著高于其他个体。两个生态型之间有基因流存在。

    4)大尺度上,基于COI(cytochrome oxidase I)谱系地理研究发现种内和种间的翅的生态型与海拔具有显著相关性,且以林线为界,林线以上几乎均为残翅,林线以下几乎均为全翅。全翅和残翅生态型都是广泛分布的,表明残翅的发生是局部地、独立地在多个区域发生的。

  • 研究意义

    本研究突出了高山林带具有快速物种形成的关键驱动力的作用,为沿海拔梯度的生态多样化提供了一个新的模型。

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