您好,欢迎光临武汉贝纳科技服务有限公司
027-62435310 | service@benagen.com | 中文 | English 咨询客服
您现在的位置:主页 > 市场与支持 > 文献解读 >

使用Nanopore和Illumina对全耐药性肺炎克雷伯菌基因组进行测序,组装和注释

本研究使用Illumina和Nanopore平台对一株全耐药性的肺炎克雷伯菌KP58进行测序,通过混合基因组组装,可以获得高质量的全基因组序列,包括1个环状染色体和5个环状质粒。该菌株具有多种抗生素耐药性和毒力因子。对粘菌素的抗性与一个类似ISKpn26插入到mgrB基因中有关;对替加环素的抗性与AcrAB外排泵系统的过度表达有关。与KP58亲缘关系最近的是从杭州收集的另一种临床分离株,仅相差10个cgMLST位点。这些数据将为肺炎克雷伯菌感染的预防、诊断和治疗策略提供重要指导。

发表杂志:Infection and Drug Resistance

发表日期:2020年2月

影响因子:3.12
 

研究背景
多药耐药性肺炎克雷伯菌在世界范围内的传播日益增加,与高死亡率的各种感染有关。本研究报道了肺炎克雷伯菌株KP58的全基因组序列,这是一种全耐药性的肺炎克雷伯菌株,在中国对粘菌素和替加环素具有较强的抗性。

 

材料方法

KP58是杭州一名89岁的患者尿液中分离培养得到,患者住院期间使用多种广谱抗生素,包括头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、替加环素和大肠菌素。进行抗菌药敏试验,测定最低抑菌浓度(MICs)。采用Illumina和Nanopore技术进行全基因组测序,组装后对基因组特征、耐药基因和毒力基因进行综合分析;对肺炎克雷伯菌KP58和密切相关的菌株进行基因组流行病学和系统发育分析。

 

主要结果

Illumina测序获得912Mb 数据,reads质量值均在Q30以上。Nanopore MinION测序获得76K reads,平均reads长度为9.8kb(N50 19Kb, 最长read 125Kb),测序数据量为746.5Mb; Q值为9的reads大于3K,数据量为368.8Mb。
 
使用混合组装,获得KP58的全基因组序列,包括1个环状染色体(5.5Mb)和5个质粒(197kb,135kb,87kb,12kb和5.6kb)(图S2)。注释到5913个蛋白编码基因,85个tRNA基因和25个rRNA操纵子;基因组完整性为98.62%,污染率和菌株异质性分别为0.36%和0%,表明组装获得的基因组质量较高。
 


图S2 全基因组圈图

注:(A)为染色体,(B)-(F)为质粒
 

与药物敏感性数据一致,KP58含有多种耐药基因,包括aadA2,rmtB,blaCTX-M-65,blaKPC-2,blaTEM-1B,blaSHV-12,blaSHV-182,qnrS1,fosA,catA2,sul2,tet(A)和dfrA14,对β-乳糖、氟喹诺酮类、酚类、磷霉素、磺胺类、四环素类和甲氧苄啶具有耐药性。此外,对喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的分析还发现了靶基因的改变,包括GyrA(S83I和D87G)和ParC (S80I)的突变。

 

 

使用qRT-PCR测定了替加环素抗性相关的外排泵基因(如acrA,acrB,ramA,marA,soxS和acrAB)的表达水平,表明KP58的替加环素抗性与AcrAB外排系统的过表达有关。还发现了无质粒载体的替加环素抗性基因tet(X)。虽然分离株对mcr基因呈阴性,但它携带了一种类似ISKpn26的元件插入到mgrB基因中,这是一种已知的赋予粘菌素抗性的插入。

 

还发现了三种潜在的毒力因子,包括对aerobactin, hypermucoviscosity(高粘液性)和 yersiniabactin(耶尔森菌素)的响应。KP58被确定为ST11型,这是一种广泛传播的多药耐药K. pneumoniae克隆系,在世界范围内造成严重感染。用Kaptive预测KP58的KL型(多糖胶囊和脂多糖O抗原),为KL64。还鉴定了属于不相容(Inc) F组[IncFIB, IncR, 和 IncFII]和ColRNAI 4个质粒的复制子。

 

使用垂直遗传核心基因组SNPs和核心基因组MLST分析,评估KP58与从中国收集的416株ST11 K. pneumoniae菌株之间的系统发育关系。系统发育树具有很高的多样性,最具地理相关的菌株被分为相同的类群,其差异为<10个SNPs(图1)。大多数从四川和杭州收集的分离株,含有最高比例的已知的抗生素耐药决定因子。结果表明,与KP58关系最密切的菌株是L39_2的,另一种从杭州人粪便样品中分离的ST11菌株,这些菌株仅有10个cgMLST位点或9个SNPs(图2)。
 

图1 ST11核心基因组系统进化树及耐药基因分布



 

图2 KP58与克雷伯菌株之间的系统发育关系

注:(A)从中国收集的所有肺炎克雷伯氏菌ST11菌株的最小生成树(B)与KP58密切相关的菌株的最小生成树。
 

在KP58质粒中,携带碳青霉烯类耐药基因blaKPC-2的IncR/IncFII 质粒(134,972bp),与中国成都分离的产生KPC-2的菌株wchkp020037的质粒pKPC2_020037具有99%的同源性和75%的覆盖率。发现pKP58-2的骨架区含有复制和稳定质粒的基因,但缺乏共轭基因。

 

质粒pKP58-2上blaKPC-2的遗传背景由Tn3-tnpA,Tn3-tnpR,ISKpn27,Tn3-ΔblaTEM-1,blaKPC-2,ΔISKpn6,korC,klcA,ΔrepB和ΔTn1721组成,几乎与三个质粒:p3_L39、p2b2和pKPC2_020037的组成相同。

 

另一个IncFII型质粒(87,095bp)含有耐药基因qnrs1、tet(A)、cata2、sul2和dfra14,已知它们分别对氟喹诺酮、四环素、酚类、磺胺类和甲氧苄啶具有耐药性。

 

 

此外,一组由iucABCD,iutA,rmpA和rmpA2组成的毒力基因均位于IncFIB/IncHI1B质粒(197,415bp)上,而在同一质粒中未检测到抗性基因。将这种毒力质粒命名为pKP58-1,并与NCBI GenBank数据库中的其他质粒进行比较,结果显示其与先前报道的三种毒力质粒具有同源性,包括pK2044(99%同源性和93%覆盖率)、pLVPK(99%同源性和89%覆盖率)和pVir-CR-HvKP4(99%同源性和78%覆盖率)。此外,pKP58-1的大小小于pK2044和pLVPK这两个质粒,但大于pVir-CR-HvKP4(178,154bp)(图3)。
 

图3 不同菌株携带的8种毒力编码质粒的遗传比较

结论

本研究使用Illumina和Nanopore平台对一株全耐药性的肺炎克雷伯菌KP58进行测序,通过混合基因组组装,可以获得高质量的全基因组序列,包括1个环状染色体和5个环状质粒。该菌株具有多种抗生素耐药性和毒力因子。对粘菌素的抗性与一个类似ISKpn26插入到mgrB基因中有关;对替加环素的抗性与AcrAB外排泵系统的过度表达有关。与KP58亲缘关系最近的是从杭州收集的另一种临床分离株,仅相差10个cgMLST位点。这些数据将为肺炎克雷伯菌感染的预防、诊断和治疗策略提供重要指导。

 

参考文献

Ruan Z, Wu J, Chen H, Draz MS, Xu J and He F. Hybrid Genome Assembly and Annotation of a Pandrug-Resistant Klebsiella pneumoniae Strain Using Nanopore and Illumina Sequencing. Infect Drug Resist. 2020;13:199-206.


Copyright © 2018 武汉贝纳科技服务有限公司 . All Rights Reserved. Designed by 鄂ICP备13016520号-1技术支持:中网维优