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Nanopore测序揭示了人细胞中内源性NMD靶向isoform

无义介导的mRNA衰变(NMD)是一种存在于真核生物的监控途径,其主要功能是通过消除含有提前终止密码子的mRNA转录物来减少基因表达错误,也可以调控正确编码全长蛋白质的mRNA表达。尽管许多基因表达NMD敏感的转录本,但使用短读长测序鉴定仍然是一个挑战。

 

该研究应用cDNA纳米孔测序和短读长测序技术对不同表达水平的人细胞进行NMD内源性靶点的鉴定和分析。鉴定到许多新的NMD敏感的 mRNA,大多数具有可变外显子事件,在3΄UTR中有更多的外显子。该研究为未来的基因组和转录组学应用提供了一个极有价值的人的NMD转录靶点资源。

 

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文章标题:Nanopore sequencing reveals endogenous NMD-targeted isoforms in human cells

 

发表杂志:Genome Biology(IF= 13.583)

 

发表时间:2021.08

 

研究材料:

 

第一组实验,在HeLa细胞中,分别使用shRNA单独干扰UPF1、SMG6或SMG7蛋白,打乱序列的shRNA干扰细胞,以及对照组KD (CTR);第二组实验,将SMG6和SMG7同时敲降,以及另一组对照组KD (CTR)(图1a)。

 

研究方法:

 

正常情况下,当NMD具有功能时,NMD靶向的RNA表达量降低,甚至无法检测到。当NMD活性降低时,NMD敏感的转录本就会积累,通过长读长测序检测到(图1b)。分析NMD敏感的mRNA的流程如图1e所示。

 

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图1 实验和分析流程

 

主要结果

 

不同样品中检测到17,000-22,000个基因,以及55,000-77,000个isoforms(图1c),平均每个基因检测到3.4个isoforms (图1d)。

 

NMD靶向特异性的RNA isoforms

该研究鉴定到的可变剪接事件类型如图2a所示。在NMD敏感转录本数据集中,最常见剪接类型是可变外显子。包含4,137外显子跳跃事件,其中有2,490个外显子包含事件和1,647个外显子删除事件(图2b)。

 

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图2 可变剪接事件和差异分析结果

 

显著差异的可变外显子事件中,约13%的外显子仅被Nanopore测序鉴定到(图2c)。在敲降组中,发生外显子跳跃的转录本比对照组的表达水平更高,经过回补实验,表达量再次降低。虽然转录本水平具有显著变化,但仅有约30%的基因差异表达(图2e)。

 

对NMD敏感的新isoform的验证

调节凋亡的Bcl-2相关athanogene-1 (BAG-1)有三种主要的蛋白isoform,长读长测序鉴定到1个新的isoform,包含1个可变外显子 (图3a)。通过PCR验证, CTR和dKD组中,蛋白编码的isoform均清晰可见,在NMD抑制后表现出明显的稳定性。

 

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图3  BAG-1和UPT11基因的可视化和PCR验证

 

UPT11基因编码人类U3 snoRNA相关蛋白11的同源物,并在酵母中鉴定出参与前18s核糖体RNA的核仁加工。该研究结果鉴定到在NMD活性下降时,有2个新的外显子显著富集,并通过RT-PCR验证,表明这2个外显子包含在两个不同的isoform中(图3b)。

 

3΄UTR的剪切事件诱导NMD不受3΄UTR长度的影响

最显著的NMD诱导特征是在终止密码子下游超过55个核苷酸处存在外显子-外显子连接。通过比较NMD敏感和NMD不敏感mRNA终止密码子下游的外显子连接数量,发现80%的NMD敏感转录本在3΄UTR中包含外显子连接,而只有31%的NMD不敏感mRNA具有这一特征(图4a)。

 

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图4 NMD敏感和NMD不敏感mRNA的特征

 

NMD敏感的mRNA平均有更长的3΄UTR(图4b)。但是,对于在最后一个外显子上有终止密码子的mRNA, 3΄UTR的长度本身与NMD敏感性无关(图4c)。

 

uORFs的存在是NMD敏感mRNA的另一个特征

上游开放阅读框架(uORFs)的翻译也被报道可以诱导NMD。虽然uORFs在所有的NMD敏感和NMD不敏感mRNA中没有明显差异,但当3΄UTR中没有外显子-外显子连接时,在NMD敏感的mRNA中的uORFs显著富集 (35.5% vs 24.9%)(图4d)。表明,uORFs和终止密码子下游的外显子-外显子连接是NMD敏感的互补特征。

 

NMD 以标准和非标准剪接产物为靶点

综合分析发现,NMD诱导的外显子的3΄(图5a)和5΄(图5b)剪切位点与对照组的剪切一致性评分存在差异,在保守性上也存在较大差异。与对照外显子相比,NMD敏感外显子的剪接位点较弱,保守性较差。有趣的是,同时存在具有更强剪接位点和更高保守性的NMD敏感外显子的小亚群 (图5)。这些结果进一步表明,NMD在转录组的形成中发挥了双重作用,主要功能是清除由异常剪接导致的转录本,也可以通过降解具有高度保守可变外显子的转录本来调节基因表达。

 

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图5 3΄和5΄端剪切位点的剪切一致性和保守性评分

 

总结

 

该研究应用Nanopore长读长测序结合Illumina短读长测序对不同表达水平的人的细胞进行NMD内源性靶点的鉴定和分析。鉴定到许多新的NMD敏感的 mRNA,并揭示了它们的生物学发生及作用的已知和未知特征。该研究为未来的基因组和转录组学应用提供了一个极有价值的人类NMD转录靶点资源。

 

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