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使用纳米孔直接RNA测序从人 mRNA 中鉴定和定量干扰素诱导的假尿苷修饰

假尿苷(Ψ是哺乳动物转录组中丰富的mRNA修饰,但由于转录组范围内的定位困难,其功能一直难以确定。作者开发了一种NanoPsu的方法,使用纳米孔直接RNA测序,对原始数据训练、机器学习建模和单个read连锁分析实现了Ψ修饰的定量。发现在干扰素刺激的基因转录本中,干扰素诱导的Ψ修饰功能与Ψ修饰在mRNA疫苗的有效性一致。

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文章标题:Interferon inducible pseudouridine modification in human mRNA by quantitative nanopore profiling

发表杂志:Genome BiologyIF= 13.583

发表时间:2021.12.6

 

主要研究结果

纳米孔测序鉴定RNA修饰的关键是从已知修饰位点生成训练集。作者从人、酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇和人类粪便细菌获得rRNA的混合物(1a)。使用亚硫酸氢盐反应后,对一半混合物进行Illumina测序,共鉴定2142Ψ位点。通过纳米孔直接RNA测序对剩余样品进行测序,鉴定到640Ψ位点,将这640个位点与随机选择的689个未修饰的U位点作为训练集。

 

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然后提取符合Ψ修饰的纳米孔信号特征。发现C突变是Ψ修饰的显著特征,一些Ψ位点也存在显著的缺失(图1b, c)。作者调查了basecalling错误的12个特征,发现Ψ位点往往具有较低的质量值和标准偏差(图1 d)。突变特征的三元图证实Ψ位点具有强烈的偏好,即被解码为C,而不是A或G(图1e)。作者采用EXT模型对每个U位点进行Ψ概率预测,发现当包含所有12个特性时,发生Ψ修饰的概率最大 (图1g)。使用EXT模型对测试集进行评估,曲线下面积(AUC)为0.9383 (图1h)。

 

使用IFN-γ或IFN-β处理细胞,进行纳米孔测序。发现IFN处理后,属于干扰素刺激基因(ISG)的转录本显著上调,该基因涉及干扰素信号通路和病毒防御机制(图2a)。表明,使用纳米孔测序技术研究干扰素应答转录组的可行性。

 

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使用EXT模型预测转录组中Ψ修饰的概率。在每个转录组中,共分析了约260万个U位点。经过IFN处理的样本比未经处理的样本有更广泛的GO terms (图2b),这表明Ψ修饰广泛分布在更多样化细胞过程的转录本中。

 

除了概率最高的500个Ψ位点之外,与未处理的样品相比,IFN处理条件下上调的基因转录本平均修饰概率更高,增加的幅度与表达模式变化密切相关(图2c, d)。Ψ修饰概率增加最多的前50个基因与干扰素途径和抗病毒反应相关(图2e)。这些结果与干扰素治疗增强ISG功能后转录组中Ψ修饰增加一致。

 

使用RT-qPCR方法验证了ISG转录本中Ψ水平的增加。Ψ-CMC在cDNA合成中引入了RT终止,与没有CMC的对照反应相比,减少了cDNA产量。通过对ISG15 mRNA表达水平和同一样本内的actin mRNA表达水平进行归一化,验证了干扰素处理后ISG15 mRNA Ψ修饰水平的增加(图2g)。

 

通过对single-read分析来定量Ψ修饰,并研究了mRNA转录单分子中Ψ位点的连锁修饰状态。该训练集包含了先前报道的100%修饰的人rRNA Ψ位点和随机选择的未修饰的U位点的数据。使用相同的特征集和相同的EXT算法,在22个部分修饰的Ψ位点(5-85%)上进行了测试,发现预测的化学计量与之前报道的LC/MS的化学计量结果匹配。(图2 h)。

 

该方法的一个创新是能够进行single-read分析,将单个mRNA转录本中的多个Ψ位点联系起来。作者在B2M转录本中选择31个位点,并通过两个样本的Kolmogorov-Smirnov检查两个位点之间的连锁关系。在大多数情况下,两个样本K-S测试的最大距离D值很小,这与位点 1 中 Ψ 的存在是一致的,与位点 2 的 Ψ 无关。这一结果表明,在单分子转录本中,两个位点的Ψ修饰对在某些部分呈负相关,而有些则完全独立。在IFN的作用下,B2M转录本的某些位点之间的联系更加突出(图2k),表明IFN诱导的Ψ组装具有更强的共依赖性。

 

总结

总之,该研究生成了一个基于监督学习的protocol来预测人类转录组中的Ψ修饰,并通过单个 reads分析Ψ,允许评估化学计量学和同一mRNA分子中Ψ位点之间的连接。在IFN作用下,内源性mRNA发生Ψ修饰变化的生物学反应,这与Ψ在IFN信号通路和病毒防御中发挥作用的生物学反应一致。

 

参考文献:

Huang, S., Zhang, W., Katanski, C.D. et al. Interferon inducible pseudouridine modification in human mRNA by quantitative nanopore profiling. Genome Biol 22, 330 (2021).

 

 

 
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