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转录组精品文献解读|长期培养对人骨髓间充质干细胞的生物学特征及RNA图谱的影响

 

正文

 

在间充质干细胞(MSCs)应用之前,体外扩增是一个必要过程。功能和基因组稳定性在干细胞治疗中具有重要作用。然而,在体外老化的人骨髓间充质干细胞(HBM-MSCs)中,编码和非编码RNA的精确表达和共表达谱系尚不清楚。本研究描绘了MSCs在传代(P)4、P6、P8、P10、P12时的形态、形态、免疫表型、增殖、分化、免疫调节能力变化,揭示MSCs的复制衰老是一个持续的过程,包括广泛改变的生物学特性和全球基因表达模式,这在MSCs的治疗应用前需要考虑。

 

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文章题目Effects of long-term culture on the biological characteristics and RNA profiles of human bonemarrow-derived mesenchymal stem cells

发表期刊:Molecular Therapy: Nucleic Acid

IF:8.886

发表时间:2021.08

 

研究背景

 

MSCs具有自我更新能力、多谱系分化潜能、免疫抑制特性、营养作用和旁分泌功能,在细胞治疗和再生医学中具有诱人的临床应用前景。HBM-MSCs在细胞培养中的应用寿命有限,约为50个种群的两倍,并且已知骨髓间充质干细胞的功能(如增殖、分化和免疫调节潜能)会随着其体外扩张而改变。在开发新的基于MSC的治疗策略时,重要考虑的是细胞内流动对细胞特征的影响。了解控制MSC增殖、衰老、特定细胞谱系分化的分子过程不仅对于治疗干预的发展至关重要,而且对确定年龄相关的MSC功能障碍的驱动因素和效应因素也至关重要。有鉴于此,本研究设计了一项分析体外扩增对HBM-MSCs的生物学特征及RNA图谱影响的研究,以期深入了解MSC老化的分子机制。

 

材料方法

 

材料:

20名年龄在20至30岁之间、没有任何重大疾病史的健康捐赠者(10名男性,10名女性),在无菌条件下从后上棘提取BM,分离和纯化MSCs后进行体外培养,在0(P0)、4(P4)、6(P6)、8(P8)、10(P10)、12(P12)天收集样本。其中P4、P6和P12组共9个样本,进行全转录组测序。

 

测序平台:

Illumina Hiseq X-ten;BGISEQ 500

 

技术路线 

 

 

主要结果

 

1、 不同传代HBM-MSCs的形态特征、种群倍增、免疫表型、分化和免疫调节的变化

本研究选择20名年龄在20至30岁之间的健康供者的MSCs进行体外培养,随后传代培养至P12原代培养时,在所有供体样本的贴壁造血祖细胞周围观察到梭形、塑料贴壁和成纤维样细胞,细胞生长,形成集落,表现为异嗜性BM-MSCs群体,,从P4到P12过程中,所有样本的增殖和细胞群倍增(NCPD)数量逐渐减少(图1B-C)。复制性衰老导致了先前报道到的典型形态学变化(图1D-E):细胞变得更大,形状不规则且平坦,细胞核变得更加局限。细胞质变得颗粒状,许多内含物以细胞碎片的形式出现。对来自P4、P6、P8、P10和P12的MSC细胞周期进行分析,发现S期和G2/M期的细胞百分比逐渐降低(图1F)。可见,在体外培养过程中,MSCs的形态异质性增加,增殖能力降低。随着传代次数的增加,表达表面标记物CD45、CD14、CD34和HLA-DR的MSCs百分比保持稳定,而表达CD90、CD105和CD73的MSCs百分比逐渐下降,尤其是CD105,从P4的94.05%下降到P12的47.38%。

 

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图1 衰老过程的形态学和增殖变化及免疫表型

 

成骨和成脂肪分化潜能在胚胎发育过程中均降低(图2A、B、D、E)。成骨过程中的减退程度比脂肪形成过程中的减退程度更为显著。同样,衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比和染色强度在后几代MSCs中增加(图2C、F),与P4相比,P12 MSCs的相对端粒长度减少(图2G)。这些结果支持了长期培养对MSCs分化潜能产生影响。

 

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图2 MSCs P4、P6、P8、P10、P12的体外分化及衰老检测

 

随着培养时间的延长,骨髓间充质干细胞抑制CD4+T细胞和B细胞增殖的能力降低。P8和P10 MSCs几乎完全丧失抑制CD4+T细胞和CD19+B细胞增殖的能力,P12 MSCs甚至增强了CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖(图3A-D)。

 

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图3 不同传代MSCs抑制T细胞和B细胞增殖的能力

 

2、 MSCs体外培养衰退过程的差异基因表达谱

选择P4、P6和P12 MSCs进行全转录组测序。与P4相比,P12的差异表达(DE)mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA,在P6表达趋势相同。共鉴定到792个RNA,其中 439个mRNA(204个上调,235个下调), 65个lncRNA(48个上调,17个下调),229个circRNA(202个上调,27个下调) ,59个 miRNA(24上调,35个下调)(图4)。

 

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图4 P4和P12组间的DE mRNA、 lncRNA、 miRNA和circRNA聚类热图

 

3、 DE mRNAs的GO、KEGG和GSEA富集分析

对以上差异mRNA进行GO、KEGG和GSEA富集分析,KEGG最显著富集的pathway包括全身性红斑狼疮,补体及凝血级联反应,Wnt信号通路,癌症信号通路和Hedgehog信号通路,它们参与免疫、信号转导、增殖和分化。GSEA富集分析显示,基因多富集于DNA复制、Notch信号、T细胞受体信号通路、Wnt信号通路(图5)等。

 

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图5 DE mRNA的GO和KEGG富集分析

 

4、 PPI和共表达网络分析

DE mRNAs的PPI共鉴定出127个节点(56个上调基因和71个下调基因)和311对相互作用。网络中评分高的节点可能在MSCs体外培养老化过程中起重要作用。该PPI网络的hub节点为MMP9、CCND1、FGF2、CXCL8,IL-8、SERPINE1和LEP。此外,获得了128对共表达的DE lncRNAs和DE mRNAs,包括32个mRNAs和6个lncRNAs。LINC01013 的靶基因数目最多,包括13种DE RNAs。LINC00607和LOC102723409也是重要的RNAs。DE lncRNA共鉴定了784个靶基因。439个DE mRNAs与784个DE lncRNA的顺/反式靶基因的交集共有8个mRNAs,其中包括ARHGAP18反式调控靶基因(图6)。

 

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图6 互作和共表达/共定位网络分析

 

lncRNA和circRNA作为互相竞争的内源性RNA (ceRNAs)发挥其生物学功能。ceRNA网络分析鉴定了由21个miRNAs、53个lncRNAs、130个mRNAs组成的204种调控关系,由16个miRNAs、59个circRNAs、98个mRNAs组成的330种调控关系。MIR99AHG、SMILR、LOC105747689、LINC01013、STXBP5-AS1、LINC01503在ceRNA网络中富集。这些基因显著富集的通路包括自噬和自噬信号通路、细胞外基质-受体互作、PI3K-Akt信号通路等。LOC102723409和ITGA6-AS1是参与该网络的关键lncRNAs。INKA2-AS1、MIR99AHG、STXBP5-AS1、SMILR、LINC01503和LOC105747689是参与自噬和线粒体自噬通路的重要lncRNAs。circRNAs ceRNA网络中发现了circ_0005773和circ_0058476等环状RNA(图7)。

 

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图7 circRNA-miRNA-mRNA相互作用的ceRNA网络

 

5、 关键RNA表达的验证

qPCR结果显示,miR-210-5p、miR-431-5p、ITGA6-AS1、INKA2- AS1、STXBP5-AS1、LOC102723409、LOC105747689、LINC01013、circ_0005773、circ_0058476、circ_0081571、circ_0081562、COMP、STC1、ADAMTS1、INKA2 CDH6、STC2、TINAGL1表达上调,miR-1908-5p、miR-16-5p、miR-122-5p、miR-193a-3p、miR-199b-5p、miR-339-5p、MIR99- AHG、LINC01503、circ_0078715、circ_0078711、SPON2表达下调(图8)。所有qPCR结果与RNA-seq结果一致。

 

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图8 关键RNA的验证

 

研究结论

 

本研究阐明了MSCs的复制衰老是一个持续的过程,包括广泛改变的生物学特性和全基因表达模式,对MSC制剂的质量控制提供分子理论基础,从而扩大MSCs的治疗应用范围。

 

参考文献

Wang S,et al. Effects of long-term culture on the biological characteristics and RNA profiles of human bonemarrow-derived mesenchymal stem cells. Molecular Therapy: Nucleic Acid.2021

 


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