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项目文章 | 新冠病毒如何引起肺炎爆发?Direct RNA测序揭秘SARS-CoV-2 的m6A修饰与病毒复制的相杀之路

早前,中国科学院武汉病毒学研究所新发传染病研究中心关武祥课题组以“Methyltransferase-like 3 Modulates Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 RNA N6-Methyladenosine Modification and Replication”为题的研究论文在期刊“mBio”上在线发表,该研究破译了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒-2 (SARS-CoV-2)RNA的m6A修饰在病毒复制过程中的调控机理,贝纳基因在该研究中承担了SARS-CoV-2的Direct RNA测序及分析工作。

 

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研究背景

 

由SARS-CoV-2引起的2019年冠状病毒病大流行是一场持续的全球公共危机。虽然有报道称SARS-CoV-2的RNA存在潜在的内部修饰,但修饰的类型和功能在病毒生命周期中的作用尚不清楚。本研究使用甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-Seq)和Nanopore Direct RNA测序(DRS) 研究了SARS-CoV-2 RNA中存在的m6A修饰作用,结果表明宿主的m6A修饰复合物与病毒蛋白相互作用并调节SARS-CoV-2的复制。该成果为宿主m6A组分与病毒蛋白相互作用调节病毒复制提供了证据。

 

病毒RNA的内部化学修饰在病毒感染的调节中起着关键作用。据报道,m6A、m5C和ac4C都参与了病毒的生命周期。m6A机制由“writers” “erasers” 和“readers"组成。“writers ", 包括甲基转移酶(METTL)3、METTL14、 WT1相关蛋白(WTAP) 和其他蛋白,催化m6A修饰的转移。“erasers”包括脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO) 和AlkB同源物5 (ALKBH5)是m6A脱甲基酶,从RNA 上去除甲基。“readers”含有一个YT521-B同源性(YTH) 基序,该基序与m6A位点结合,在mRNA稳定性、RNA加工、RNA结构和翻译中发挥关键作用。

 

材料方法

 

SARS-CoV-2 (IVCAS 6.7512) 从中国科学院武汉病毒研究所病毒资源中心获得,并在猴肾细胞(Vero E6细胞)中传代8代。

 

研究结果

 

1、 SARS-CoV-2感染改变了m6A甲基转移酶和去甲基化酶的表达模式

在细胞质中复制的病毒会影响甲基转移酶和脱甲基酶的表达和定位,以促进其RNA m6A的修饰,从而影响病毒的复制。SARS-CoV-2感染48小时(hpi) 后,Vero细胞中METTL3的表达有所增加,而METTL14和WTAP的表达水平不受影响(图1A) 。去甲基化酶FTO的表达在48 hpi时下降,而ALKBH5的表达在感染后没有变化。此外,在SARS-CoV-2感染期间,m6A结合蛋白YTHDF1-3、YTHDC1和YTHDC2的表达没有改变(图1A)。

 

随后作者确定了SARS-CoV-2感染对甲基转移酶和脱甲基酶定位的影响。与以前的结果一致, 正常情况下,甲基转移酶和去甲基化酶主要在细胞核中被检测到(图1B-F)。然而感染后,METTL3、 METTL14、 WTAP、ALKBH5和FTO都同时存在于细胞核和细胞质中(图1B至F) 。甲基转移酶和去甲基化酶与病毒N蛋白的共同定位意味着这些蛋白可能在细胞质中与SARS-CoV-2 RNA相互作用。

 

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图1  SARS-CoV-2感染影响了m6A相关蛋白的表达模式

 

2、 SARS-CoV-2 RNA含有m6A修饰

为了探索SARS-CoV-2 RNA是否经过m6A修饰,从大批量的SARS-CoV-2感染的Vero E6细胞中纯化出总RNA进行MeRIP-seq,在5‘端和3’端发现了五个m6A峰(图2B-D) ,意味着SARS-CoV-2 RNA在感染期间发生了m6A修饰。为了进一步证实m6A的修饰位点,作者对从感染SARS-CoV- 2的Vero E6、 A549 ACE2和Huh7细胞中提取的总RNA进行了DRS分析,与MeRIP-Seq结果一致,在不同的感染细胞系中,大多数m6A位点分布在5‘和3’端(图2E-G)。


 

图2 SARS-CoV-2 基因组RNA存在m6A修饰

 

3、 METTL3促进了SARS-CoV-2 RNA的m6A修饰和病毒的复制

MeRIP结果显示SARS-CoV-2 RNAs被METTL3拉下(图3B) ,表明SARS-CoV-2 RNA可以与METTL3相互作用。shRNA沉默METTL3导致SARS-CoV-2 RNA中m6A的丰度下降(图3D-E) ;相反,通过转染使METL3过量则增加了与m6A结合的SAR-CoV-2 RNAs的丰度(图3C)。表明SARS-CoV-2基因组中的m6A修饰水平与METL3的表达有关 (图3G) 。

 

图3 METTL3催化了SARS-CoV-2的m6A修饰

 

Vero E6细胞中的内源性METTL3或FTO被特定的shRNAs敲除,然后进行SARS-CoV-2感染以检查METL3或FTO是否影响病毒复制(图4A-B)。结果发现,有效地敲除METTL3不仅导致病毒滴度(图4E)和病毒N和RdRp基因拷贝数(图4C-D)的显著下降,而且还降低了病毒N基因的表达(图4A)。然而,敲除FTO却有相反的效果(图4B、F-H)。以上表明,m6A甲基转移酶METTL3与高效的SARS-CoV-2复制有关。

 

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图4 METTL3和FTO调节SARS-CoV-2的复制

 

4、 SRAS-CoV-2 RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)与METTL3相互作用,促进其表达

将pFlag-METTL3和pHA- RdRp共转染到Huh7和HEK293T细胞中,用抗Flag抗体进行IP实验,结果显示METTL3与SARS-CoV-2的RdRp蛋白在没有或有RNase A时相互作用(图5A-B),与METTL3相互作用的功能域为RdRp-N(图6B-C) ,而不是RdRp-C (图6D-E)。当RdRp共同表达时,METL3同时分布在细胞核和细胞质中(图5E-F)。然而,共同表达SARS-CoV- 2的非结构蛋白NSP16对METTL3的亚细胞定位没有影响。此外,METTL3的表达随着RdRp的转染而增加,反之亦然(图5C-D) ,表明METTL3和RdRp的丰度影响了RdRp或METTL3的表达。

 

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图5 SARS-CoV-2 RdRp与METTL3相互作用并影响其表达

 

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图6 RdRp的N端和METTL3相互作用

 

5、 SRAS-CoV-2 RdRp抑制了METTL3的苏木酰化和泛秦化

为了解病毒蛋白RdRp如何影响m6A机制的成分,首先考察不同感染时间所有m6A “writers”、“erasers”及“readers"的RNA丰度,显示SARS-CoV-2并不影响m6A相关蛋白的RNA表达水平。转录后修饰,如泛素化和苏木酰化,影响METTL3蛋白的丰度和功能。接下来调查RdRp是否影响METTL3的修饰。WB结果显示,在RdRp表达的情况下,METTL3的苏木酰化程度降低。与pMETTL3、FlagRdRp和HA-Ub共转染可降低METTL3的泛素化。进一步的实验表明,RdRp的过量表达导致K48连接的泛素化和K63连接的泛素化减少(图7) 。

 

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图7 RdRp的表达抑制了METTL3的苏木酰化和泛素化

 

研究结论

 

本研究发现METTL3发挥甲基转移酶的作用,将m6A修饰添加到病毒RNA中。其次,METTL3与病毒RdRp相互作用,导致METTL3分布在细胞核和细胞质中。重要的是,RdRp借助一种未知的机制通过改变泛素化模式来促进METTL3的表达。该成果为宿主m6A机制与病毒关键蛋白相互作用促进SARS-CoV-2的复制提供了证据。

 

文章链接

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mBio.01067-21

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