• MutMap:快速突变体定位

    野生型经EMS诱变得到突变型,突变株多代自交至纯合后与野生型杂交得到F1,F1自交得到F2,出现性状分离。

    选择F2中与野生型表型不一致的个体若干株混池测序,同时将野生型测序作为参考基因序列。

    将SNP-Index(与参考序列不同的reads占总reads的比例)显著高于期望的SNP位点作为引起该突变的候选位点。

  • 常见问题

    1. 每个个体分别提取DNA再混池还是样品混池再提取DNA?

    先提DNA再等量混合,可以减少系统误差。有文献提到两种方法没有明显差异,但并未给出数据支持。建议结合实际情况选择。

    2. 突变型无法与野生型杂交怎么办?

    除了MutMap的标准流程,在实际应用中可以灵活变通,只要能生成足够的隐性纯合子代即可。比如突变型无法与野生型杂交时,可以将突变株进行自交得到子代池。

    3. 子代池应该包含多少个个体?测序深度多少?

    个体数目:20到50个,推荐30个。

    测序深度:20X到50X,推荐30X。

    4. 如何降低假阳性?

    在EMS诱变时,除了导致Causal mutation, 还会产生其他SNP变异。这些变异中,部分会在自交过程中纯化并保留下来,在分析中无法与Causal mutation区分。

    R Fekih等于2013年提出MutMap+, 使突变体自交产生性状分离。利用分离的个体,分别混池测序。通过比较SNP-Index差异,消除噪音SNP。

  • 参考案例

    用MutMap方法定位水稻耐盐性性状控制基因

    文献名称:MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar

    发表期刊:Nature Biotechnology

    发表时间:2015年3月

    影响影子:43.113

    研究概述

    2011年地震和海啸导致日本20000多公顷的稻田被海水淹没造成盐污染。由于日本当地缺少耐高浓度盐的水稻品种,急需培育耐盐性的水稻新品种。

    作者通过对地方品种Hitomebore进行EMS诱变,得到耐盐突变体hst1。

    通过MutMap方法,定位到导致基因失活的SNP,从而导致耐盐。

    培育出耐盐新品种Kaijin,它与Hitomebore仅有201个SNP差异。其生长情况和产量都与Hitomebore一致。

    整个新品种的培育过程仅2年时间。

    NaCl容液处理

    方案设计

    1.通过对地方品种Hitomebore进行EMS诱变,筛选出6000个突变株;

    2.将突变株用1.5%NaCl处理,发现耐盐突变体hst1;

    3.Hitomebore与hst1杂交得到F1,F1自交得到F2;

    4.使用0.75%NaCl对F2个体进行处理,不耐盐与耐盐比例为133:54,经卡方检验,符合3:1的分离比,说明耐盐性状由一个隐性突变控制;

    5.选取20株耐盐F2,提取DNA等量混合测序;

    6.亲本Hitomebore,单独建库测序,测序深度为28.7X;

    7.20个耐盐子代混池测序,深度为18.4X。

    研究结果

    1.在chromosome 6上2.76~8.57M区域,SNP-Index显著偏离0.5,该区域包含2个SNP,其中一个位于基因OsRR22第三个外显子上,该基因编码B-type response regulator。该SNP导致基因提前终止,失去功能;

    2.通过转座子插入,及PCR实验,证明使OsRR22失活可产生耐盐表型;

    3.通过RNA-Seq技术,研究基因表达差异,发现该突变只影响了少量基因的表达,但并未能明确导致耐盐的机制;

    4.以耐盐突变体hst1作为母本,以Hitomebore为父本进行杂交,培育出耐盐品种"Kaiji"。该品种保留了其亲本优良的产量性状和品质性状的同时,其耐盐性也与突变体hst1 保持在同一水平上。该品种于2015年于当地推广。

     

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