• MutMap:快速突变体定位

    野生型经EMS诱变得到突变型,突变株多代自交至纯合后与野生型杂交得到F1,F1自交得到F2,出现性状分离。

    选择F2中与野生型表型不一致的个体若干株混池测序,同时将野生型测序作为参考基因序列。

    将SNP-Index(与参考序列不同的reads占总reads的比例)显著高于期望的SNP位点作为引起该突变的候选位点。

  • 常见问题

    1. 每个个体分别提取DNA再混池还是样品混池再提取DNA?

    先提DNA再等量混合,可以减少系统误差。有文献提到两种方法没有明显差异,但并未给出数据支持。建议结合实际情况选择。

    2. 突变型无法与野生型杂交怎么办?

    除了MutMap的标准流程,在实际应用中可以灵活变通,只要能生成足够的隐性纯合子代即可。比如突变型无法与野生型杂交时,可以将突变株进行自交得到子代池。

    3. 子代池应该包含多少个个体?测序深度多少?

    个体数目:20到50个,推荐30个。

    测序深度:20X到50X,推荐30X。

    4. 如何降低假阳性?

    在EMS诱变时,除了导致Causal mutation, 还会产生其他SNP变异。这些变异中,部分会在自交过程中纯化并保留下来,在分析中无法与Causal mutation区分。

    R Fekih等于2013年提出MutMap+, 使突变体自交产生性状分离。利用分离的个体,分别混池测序。通过比较SNP-Index差异,消除噪音SNP。

  • 参考案例

    用MutMap方法定位水稻耐盐性性状控制基因

    文献名称:MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar

    发表期刊:Nature Biotechnology

    发表时间:2015年3月

    影响影子:43.113

    研究概述

    2011年地震和海啸导致日本20000多公顷的稻田被海水淹没造成盐污染。由于日本当地缺少耐高浓度盐的水稻品种,急需培育耐盐性的水稻新品种。

    作者通过对地方品种Hitomebore进行EMS诱变,得到耐盐突变体hst1。

    通过MutMap方法,定位到导致基因失活的SNP,从而导致耐盐。

    培育出耐盐新品种Kaijin,它与Hitomebore仅有201个SNP差异。其生长情况和产量都与Hitomebore一致。

    整个新品种的培育过程仅2年时间。

    NaCl容液处理

    方案设计

    1.通过对地方品种Hitomebore进行EMS诱变,筛选出6000个突变株;

    2.将突变株用1.5%NaCl处理,发现耐盐突变体hst1;

    3.Hitomebore与hst1杂交得到F1,F1自交得到F2;

    4.使用0.75%NaCl对F2个体进行处理,不耐盐与耐盐比例为133:54,经卡方检验,符合3:1的分离比,说明耐盐性状由一个隐性突变控制;

    5.选取20株耐盐F2,提取DNA等量混合测序;

    6.亲本Hitomebore,单独建库测序,测序深度为28.7X;

    7.20个耐盐子代混池测序,深度为18.4X。

    研究结果

    1.在chromosome 6上2.76~8.57M区域,SNP-Index显著偏离0.5,该区域包含2个SNP,其中一个位于基因OsRR22第三个外显子上,该基因编码B-type response regulator。该SNP导致基因提前终止,失去功能;

    2.通过转座子插入,及PCR实验,证明使OsRR22失活可产生耐盐表型;

    3.通过RNA-Seq技术,研究基因表达差异,发现该突变只影响了少量基因的表达,但并未能明确导致耐盐的机制;

    4.以耐盐突变体hst1作为母本,以Hitomebore为父本进行杂交,培育出耐盐品种"Kaiji"。该品种保留了其亲本优良的产量性状和品质性状的同时,其耐盐性也与突变体hst1 保持在同一水平上。该品种于2015年于当地推广。

     

  • QTL-Seq:快速QTL定位

    将两个具有极端性状的亲本杂交,得到F1,F1自交得到F2,出现性状分离。

    将F2中具有极端性状的个体分别混池测序,同时对两个亲本进行测序。

    分别计算SNP-Index,差异显著大于0的SNP位点作为候选QTL位点。

  • 常见问题

    1. 每个个体分别提取DNA再混池还是样品混池再提取DNA?

    先提DNA再等量混合,可以减少系统误差。有文献提到两种方法没有明显差异,但并未给出数据支持。建议结合实际情况选择。

    2.每个子代池应该包含多少个个体?

    • 质量性状

    每个池混的个体越多,能够去除的噪音SNP越多,结果越精确,建议不少于20个。

    • Large effect QTL

    2013年,James 等对混池个体数和测序深度对候选基因数的影响进行了评估。当子代个数超过20个,测序深度达到25X以后,候选基因个数会趋于平衡,不会有更明显的提升效果。基于以上文章经验以及已完成的BSA项目经验,推荐30个个体进行混池,每池30X的测序深度。

    • Medium和Small effect QTL

    需要更大的群体,更极端的个体混池才能够定位。具体方案如下:

    3. 亲本测序深度多少?

    亲本建议深度为10X~30X, 10X可以准确鉴定SNP变异,30X可以覆盖基因组绝大部分区域。

    4. 是否可以只测一个亲本?

    数据分析过程中,以一个亲本作为参考序列,另一个亲本用于比较,降低假阳性。根据项目经验,如果只测一个亲本,会增加一定假阳性,但在可以接受的范围内。

  • 参考案例

    使用QTL-Seq对水稻稻瘟病抗性和幼苗活力控制基因进行定位

    文献名称:QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations

    发表期刊:The Plant Journal

    发表时间:2013年2月

    影响影子:5.468

    研究概述

    大多数农艺性状都属于数量性状,传统的QTL定位方法费时费力。这篇文章结合BSA思路和高通量测序技术,首次提出QTL-Seq技术。并以水稻稻瘟病为例,分别基于RIL群体和F2群体,成功定位到控制位点。

     

    QTL-Seq与MutMap最大的不同在于研究的材料不同:MutMap是用诱变得到的材料,而QTL-Seq可用于自然存在的材料。

     

    QTL-seq的原理如右图,将两个具有极端性状(如株高的高矮)的亲本杂交,得到F1,F1自交后得到性状分离的子代池F2,经过检验发现F2的性状成正态分布,说明这是一个数量性状。将F2中的极高和极矮个体分别混池测序,计算每个SNP位点的SNP-Index(该位点与参考序列不同的reads数占总reads数的比例),然后将两个SNP-Index相减得到ΔSNP-Index,将ΔSNP-Index显著偏离0的位点作为候选位点。

    基于RILs群体定位稻瘟病抗性基因

    • 方案设计

    1. 稻瘟病菌M.oryzae 会导致水稻稻瘟病。Nortai对M. oryzae 有抗性,Hitomebore易感(a);

    2. 通过两者杂交,得到F2后,自交至F7得到241个RILs;

    3. 使用M. oryzae侵染241 RILs,按照抗性从抗病到易感分为4~10个等级(b),侵染步骤重复4次/4年以确定分级正确。每个等级包含的个体数目呈正态分布,表示该抗性为多基因控制;

    4. 分别选择20个极端个体(R-bulk, S-bulk),混池测序(c);

    5. 分别计算每个池的SNP-Index和两池之间的△SNP-Index, 选择P<0.01区域作为候选;

    6. 使用传统QTL方法进行验证。确定方法可靠性。

    • 研究结果

    1. 定位到染色体上2.39~4.39M的一段区间为候选区域;

    2. 使用传统方法验证,定位到0~4.9M为候选区域,与QTL-Seq基本一致。证明方法可行。

    基于F2群体定位幼苗活力基因

    • 方案设计

    1. Dungeon Shai相对于Hitomebore更具有幼苗活力(a);

    2. 已确定chr3上有一个主效QTL qPHS3-2,可能对应基因OsGA20ox1gibberelllin (GA) byosynthesis 有关。这里利用QTL-Seq检验是否可以检测到该QTL;

    3. Dungeon Shai和Hitomebore作为亲本,最终得到531个F2,性状分布符合正态分布(b);

    4. 选择极端性状各50株,混池(H-bulk, L-bulk), 测序(b);

    5. 分别计算每个池的SNP-Index和两池之间的△SNP-Index(c)。

    • 研究结果

    1. 候选区域:chr3:36.21M~37.31M; chr1:39.08~41.08M;

    2. 包含了之前定位到的QTL。证明方法可行。

     

     

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