葡萄是最重要的经济作物之一，黑比诺（Pinot Noir）是勃艮第的主要酿酒红葡萄品种，目前已被世界各地的葡萄酒产区广泛采用。

该研究使用PacBio HiFi测序技术为酿酒葡萄黑比诺（PN40024）组装了一个端粒到端粒（T2T）参考基因组（PN_T2T），与旧版本12X.v2相比在组装的完整性和准确性方面均有显著提升。PN_T2T共注释得到67%重复序列、19个着丝粒和36个端粒，为葡萄遗传学和育种提供了重要资源。

文章题目：The complete reference genome for grapevine (Vitis vinifera L.) genetics and breeding

发表期刊：Horticulture Research（IF=7.291）

发表时间：2023.04

1、 端粒到端粒gap-free的参考基因组——PN_T2T

PN40024是一种高度纯合的黑比诺品种，使用PacBio平台测序，总共生成了21 Gb（~42×）HiFi数据。使用Hifiasm进行基因组组装，用已发表的葡萄基因组作为参考，用Mummer将38个contigs排列为19条染色体（图1），初步组装后只剩下一个gap。再用HiFi reads填补gap，最终生成了一个gap-free的PN_T2T基因组（494.87 Mb），比旧参考基因组12X.v2（426.18 Mb）长69 Mb。

表1 12X.v2和PN_T2T组装的基因组特征比较

图1葡萄的T2T gap-free参考基因组

2、 端粒和着丝粒

作者检查了每条染色体两端的150 kb序列，端粒重复单元的长度范围设置为5至12 bp。最后，检测到端粒重复单元（TTTAGGG/CCCTAAA），检测到PN_T2T基因组中含36个端粒，除了15号和17号染色体的短臂区域未检测到端粒重复序列（图1A，图2B）。其中，最长的端粒（31 kb）在8号染色体的短臂中，重复4479次，而最短的端粒（1260 bp）在7号染色体的长臂中，只有180次重复。

图2 PN_T2T参考基因组中的重复序列注释

此外，为了检测着丝粒区域，该研究对30至500 bp的候选重复序列进行搜索，使用TRF在PN_T2T基因组中发现了470个不同的重复单位，其中107个bp重复是全基因组中最丰富的重复单元，约占基因组的3.95%，其次是321 bp（2.45%），214 bp（1.94%）和135 bp（1.05%）（图3A）。并且，214 bp和321 bp重复单元的序列分别由107 bp重复单元的两个和三个拷贝组成，TE分析也支持107bp重复区域的着丝粒特征（图2）。因此，作者用107bp重复序列鉴定着丝粒，并定位在所有19条染色体上（图1A，图2B）。

图3 PN_T2T基因组中的着丝粒重复单元示意图

作者进一步筛选了高度连锁着丝粒区域中的所有基因。有意思的是，作者在着丝粒中鉴定到343个基因，其中包括179个具有Uniprot ID的基因。通过GO功能注释、富集分析，发现多个基因富集到与蛋白质结合、生长素转运蛋白、生殖发育、光形态发生等通路上（图4C）。

图4 着丝粒中重复单元拷贝的特征和分布

3、 葡萄参考基因组中的基因簇

作者在葡萄参考基因组中总共鉴定到377个基因簇，这通常涉及局部重排，并且扩展到涉及数十到数百个基因的巨型碱基（图5）。在16号染色体（23-27 Mb）上，有599个基因富集的结构域（图5A）。在18号染色体（25~36 Mb）上，有1237个基因富集结构域（图5B）。其中，许多强富集的结构域是植物抗病基因（R基因）结构域的一部分。该研究分析了 41064 个 PN_T2T PCGs的结构域，并鉴定到3381个可能的R基因。这些R基因和基因簇为探索植物防御机制提供了重要线索。

图5 已鉴定的基因簇示意图

4、 自交九代后的遗传杂合情况

该研究以PN_T2T为参考基因组，从NCBI下载了四个PN40024的重测序数据并进行分析。共检测到244215个SNP，其中208330个SNPs（85.3%）在所有四个样本中共享，而其他35886个SNP仅在1-3个样本中出现（图6A）。作者认为，前者可能是自交九代后PN40024的原始变异，而后者可能是在不同实验室和组织培养过程中产生的体细胞突变。

图6 PN40024中杂合子区的特征分析

有趣的是，作者发现常见变异的hotspots在核心生物过程中富集，包括氧化还原过程和蛋白质磷酸化过程。2号染色体上的hotspots还富集在性别决定QTL区域（图6），这使性别决定基因的挖掘变得复杂，因为候选基因并没有出现在旧版本的参考基因组中。

该研究使用PacBio HiFi测序技术，为酿酒葡萄黑比诺（PN40024）组装了一个端粒到端粒参考基因组（PN_T2T）。与旧版本参考基因组相比，PN_T2T在完整性和准确性方面均有显著提升，通过对基因簇、杂合区域等分析，发现其与香气和抗病性等复杂性状关联。总之，完整组装并注释的葡萄T2T参考基因组为葡萄遗传学和育种提供了重要资源。

参考文献：

Xiaoya Shi, et al. The complete reference genome for grapevine (Vitis vinifera L.) genetics and breeding, Horticulture Research, 2023.