中文题目：印度恒河河段人为干扰区域微生物组和抗性基因谱的时空变化

发表期刊：Science of The Total Encironment(IF: 10.753)

发表时间：2023.5

发表单位：印度国家化学实验室生化科学部工业微生物国家收藏中心

★首次报道了印度恒河下游1500公里范围内的微生物组和耐药基因组成。

★检测到23种金属和28种抗生素的耐药基因。

★首次报道了推测的宿主-噬菌体连接功能的宏基因组数据。

★存在用于病原和腐败菌的噬菌体。

对恒河流域样品进行ONT测序，首先分别对古菌，细菌进行群落结构、多样性分析和差异分析。接下来对病毒进行群落结构及多样性分析，预测病毒潜在的功能。其次对ARG和MRG进行鉴定、丰度分析、差异分析、可移动元件分析及潜在宿主分析。以季节性差异对恒河的微生物群落及抗性基因的影响。

图形摘要

抗生素和金属抗性基因(ARG/MRGs)的存在是古老的，各种人为行为增加了它们的传播。世界卫生组织(WHO)已将ARGs视为一种新污染物。任何环境中过量的金属和抗生素都会对微生物群落施加选择压力，并最终改变其多样性。人类活动主要影响淡水生态系统，如河流和湖泊，因此是ARGs和MRGs激增和演化的热点。

恒河是印度的国家河流，为数百万人民提供生命线。但河流沿岸和流域区域的人类活动对其污染做出了主要贡献，各种未经处理的废物排放改变了该河流系统的水质。这些污染物最终导致恒河的微生物群落受到巨大影响，并对公共卫生造成了巨大影响。

目前只有少数以宏基因组为基础的研究强调了这个河流系统中ARGs和MRGs的存在，且仅限于恒河的特定位置，缺乏全面了解其广阔地理范围的抗性基因组学。本研究是第一项利用MinION纳米孔测序技术，全面探究了季节变化下、从哈里达尔到巴加尔布尔约1500公里的受人类影响的恒河全部微生物群落和相关抗性基因组(ARGs和MRGs)。

1. 样品收集和研究地点描述

本研究选取了长约1500公里的恒河断面，以绘制抗生素和重金属抗性基因的库。在2017年12月和2018年6月的两个不同季节，从河流的左岸(LB)、中部(M)和右岸(RB)的15个位置收集了沉积物样品(深度约20厘米)，每个位置分别采集了三个样品(n = 90)。同时进行理化性质和元素测定。

图1 样本采集地点示意图

2. 宏基因组测序

使用Nanopore MinION R9平台测序

3. 数据处理

碱基识别：Albacore(v2.3.4)。条码拆分：qcatv1.1.0。去接头和嵌合体：Porechop(v0.2.1)。数据标准化：DESeq2。数据稀释：MG-RAST。数据统计：NanoPlot和NanoStat。数据分布及检验Shapiro-Wilk normality test (p-value threshold of 0.05)和Q-Q plot。

4. 微生物多样性和统计分析

功能和物种注释：MG-RAST(evalue 1e-5 ; identity 50%)和Kaiju v1.7.3。数据过滤：单OTU的分类。α多样性计算：phyloseq。差异显著性检验：ANOISM(p=0.05)和PERMANOVA。误差校正：Benjamini-Hochberg(BH)FDR和Bonferroni。β多样性分析：vegan包。

5. 抗性组学分析

抗生素耐药基因(ARGs)：NanoARG(--iden 25 - -cov 40 - -evalue 1e-5 - -prob 0.5)。

金属耐药基因(MRGs)：NanoARG比对Bacmet数据库(--evalue 1e-5 --id 25 --coverage 1e-5)。

移动遗传元件(MGE): NCBI nr数据库提取的移动元件数据库。

差异显著性检验：Kruskal-Wallis (KW) test (p = 0.05)。

物种分类：Centrifuge。

1. MRGs的丰度、发生率及多样性

使用NanoARG中的BacMet数据库调查了金属抗性基因及其相关的分类群。分析表明，在所有采样地点都存在23种不同金属的MRGs。主要的MRGs提供了对铜(22.38 ± 5.97%)、锌(21.15 ± 7.43%)、银(11.79 ± 3.90%)、砷(10.09 ± 4.51%)和铁(7.93 ± 4.13%)的抗性 (图2)，然而在季节比较方面，所有位置的金属抗性基因的组成异质性没有显著差异 (p > 0.05 ANOVA with BH correction)。对其他河流系统的研究，如萨凡纳河(美国)、湘江(中国)和长江(中国)也显示出类似的结果，其中铜、锌和铅/镉/砷是最丰富的MRGs。恒河被尊为灵性的象征，人们将各种金属作为供品奉献，这可能会影响MRG的多样性。其他显著的MRGs是对钴、镍和钼的抗性。此外，所有样品中还检测到毒性重金属汞(3.5±0.78％)、铅(3.3±0.76％)和镉(1.92±0.12％)的耐药基因，但丰度较低。

图2. 印度恒河金属抗性基因(MRGs)的丰度和多样性

2. ARG的丰度和传播

为了描绘恒河全面的耐药基因组成，本研究显示存在28类抗生素抗性基因。所有地点中最丰富的抗药基因是multidrug/多重抗生素耐药性的基因(39.67±3.68%)，其次是bacitracin(7.70±1.37%)；peptide(7.65±0.95%)；tetracycline(6.86±1.23%)和glycopeptide(5.3±1.14%)(图3A)。这先前与通过扩增子测序、抗生素敏感性测试和从恒河中分离MDR细菌的研究的情况一致。然而，这些研究仅限于恒河的特定位置，本研究是第一项跨越两个季节全面了解恒河耐药基因组成的研究。此外，恒河中存在bacitracin、glycopeptide 和 tetracycline耐药性表明水和下部沉积物受到来自各种来源的人类输入(如污水和医院/工业/家庭废物)的污染。

图3. 恒河抗生素耐药基因的丰度和多样性。3A：抗生素耐药基因的类别。3B：显著富集的抗生素耐药基因类别。3C：相对丰度，描述包含抗生素耐药基因的前20个基因。3D：显著抗生素耐药基因类别的季节比较。

3. 恒河细菌群落结构分析

在所有位置和两个季节中观察到了152个细菌门和3256个细菌属。在所有样品中，变形菌门(45.89 ± 4.16%)是最普遍的门，其次是放线菌门(9.64 ± 1.46%)，绿弯菌门(9.36 ± 2.19%)，酸杆菌门(8.54 ± 3.37%)和拟杆菌门(7.35 ± 3.39%)(图4A)。在两个季节中，细菌群落的整体组成在门水平上保持相似(p > 0.99；ANOVA，BH校正)(图4B)。然而，Candidatus Handelsmanbacteria(p=0.0041)、Candidatus Kryptonia(p=0.0173)和Candidatus Kaiserbacteria(p=0.0356)是在门水平上随着季节变化而有所不同的显著分类群。Candidatus Handelsmanbacteria和Candidatus Kaiserbacteria在降雨季后样品中显著富集，而Candidatus Kryptonia在降雨季前样品中更为普遍(图4C)。古菌门(10%)和拟杆菌门(8%)在降雨季前(干季)的样品中有所增加。在属水平上，链霉菌属(Streptomyces)(17％-32％)在除G13US、JG14US、J / G14DS、G15Y、JG16US、J / G16DS以外的所有位置都是优势属，这些位置观察到优势属为硝化螺旋菌属(Nitrospira)(19％-32％)。链霉菌被认为是制药产品(如抗生素和工业酶)的优秀生产者，被广泛认为是新型次级代谢产物的重要来源。基于宏基因组测序可以在探索恒河河床沉积物中寻找有前途的链霉菌菌株及其潜在的生物勘探方面发挥重要作用。其他重要的属包括假单胞菌属(Pseudomonas)(16.08 ± 12.65%)、根瘤菌属(Bradyrhizobium)(4.55±1.55%)和单胞菌属(Sphingomonas)(4.75 ± 1.43％)(图4D)。季节变化对属水平上的细菌多样性没有显著影响(p>0.99; ANOVA with BH correction)(图4E)。然而，共有127个显著的细菌属在季节变化中发生变化，而另外475个在空间上有差异(p <0.05)。

Pseudomonas在JG15Y和J/G15DS(n = 28-67％)占主导地位。然而，在G15DS(67.24％)和JG15DS(45.97％)观察到显著的增加(Wilcoxon检验p值=0.0156)。这可能与J/G15Y(50.4±2％)和J/G15DS(55.2±5.1％)的变形菌门相对丰度显著增加有关。结果与我们以前的研究相一致，在Prayagraj的Triveni Sangam，印度河雅穆纳河与恒河交汇处，Pseudomonas数量显著增加。这可能是上述汇流的属性。此外，Bijnor存在Pseudomonas作为优势菌属的原因可能来源四个排水口的废水(WW)(17％)。

图4. 恒河的细菌群落组成。4A：前15个相对丰度最高的细菌门。4B：Top 15个细菌门的季节性比较。4C：显示在季节性变化方面有显著差异的门水平的重要分类群的图表。4D：前15个相对丰度最高的细菌属。4E：Top 15个细菌属的季节性比较。

4. 恒河古菌群落分析

恒河河流的古细菌多样性一直未得到充分研究。本研究在所有样本中，Euryarchaeota占优势，平均相对百分比为(38.93±13.54%)，其次是Thaumarchaeota(37.91±19.97%)；Candidatus Bathyarchaeota(6.23±3.91%)；Candidatus Woesearchaeota(3.14±2.46%)和Crenarchaeota(2±0.45%)(图5A)。虽然在门水平上观察到了Euryarchaeota的占优势，但Thaumarchaeota门的成员在属水平上更为丰富。许多研究表明，在各种废水(WW)、废水处理厂和活性污泥中普遍存在AOA和甲烷菌。在恒河中发现这些属表明，水的污染是通过人类干预形成考古细菌群落结构的驱动力(图5B)。此外，对样本进行季节比较以评估门和属水平上考古细菌多样性的差异，未发现显着差异(图5C，D)。本研究是首个对恒河流域1500公里跨两个季节内的古细菌群落组成的研究。

图5. 恒河区域古菌群落组成。5A：前15个古菌门的相对丰度。5B：前15个古菌属的相对丰度。5C、D：前15个古菌门(5C)和前15个古菌属(5D)的季节性比较。

5. 恒河病毒群落结构分析

在目水平上，主要包括未分类病毒(62.55±9.79%)，其次是头虾病毒目(33.55±8.49%)和疱疹病毒目(3.90±8.49%)(图6A)。与代表细菌和真核生物的序列相比，病毒序列在参考数据库中的比例较低。这必然影响了环境宏基因组中报道的病毒多样性，导致大量未分类的病毒序列。将病毒序列在科水平上进一步分类，发现巨型病毒家族Mimivirade占主导地位(31.68±11.16%)，其次是Siphoviridae(19.09±5.06%)、Myoviridae(11.23±4.44%)和Phycodnaviridae(7.38±2.83%)(图6B)。这些病毒家族的高比例可能归因于水污染的程度增加，这导致了恶化的河水质量，从而调节了微生物群落结构。此外，季节变化对病毒部分的影响不大(ANOVA p> 0.05，BH校正)(图6 C，D)。

图6。恒河的病毒群落组成。6A：病毒目的相对丰度。6B：前10个病毒科的相对丰度。6C、D：病毒目(6C)和前10个病毒家族(6D)的季节比较。

6. 微生物多样性指数估计

使用观测的Shannon和Simpson多样性指数评估了两个季节古菌群落的α多样性。虽然没有显著性差异，但在雨季后观察到了更多的OTUs。早雨季样品具有更高的丰富度和均匀度(图S2 A)。季节变化对考古菌多样性没有显着影响(图S2 B)。

7. 理化因素和重金属对微生物多样性的影响

在本研究中，我们评估了pH、温度、溶解氧和重金属 (As、Cd、Cr、Hg、Ni、Pb 和 Zn) 等理化性质对两个季节的微生物组成的影响。所有位置都观察到了较高浓度的Zn (32-57mg/kg)，其次为Cr (8-50 mg/kg)、Ni (4-14 mg/kg) 和Pb (1-12 mg/kg)。然而，只有在G12DS、JG13US、JG15US 和G17US 的少数下游位置中发现了汞的富集。季节变化对恒河河床沉积物中金属的影响不显著(p > 0.05 ANOVA with BH correction) (图S3)。我们的结果与其他关于恒河的研究一致。NMDS分析表明，温度和重金属在两个季节的所有站点中都是正向影响微生物多样性的关键驱动因素。相反，溶解氧、pH 和砷与轴的负相关性比镉高(图 S4)。

8. MRGs的微生物宿主及其相关功能

变形菌门(Proteobacteria)占河恒河金属耐药基因库成员的显著部分(91.37%)，其次是放线菌门(Actinobacteria)(4.31%)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)(3.44%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(0.86%)和厚壁菌门(Firmicutes)(0.86%)(图7A)。随后，在属水平上进行了分类注释，共发现116种古菌物种携带MRG。对于大多数MRG类别，观察到假单胞菌属(Pseudomonas)(28.44%)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)(4.31%)、地球杆菌属(Geobacter)(4.3%)、黄单胞菌属(Xanthomonas)(3.44%)和潘多拉菌属(Pandoraea)(3.44%)占主导地位(图7B)。分析与铜和锌稳态相关的功能。在所有样品中观察到铜转运P型ATP酶(CopA)(26.77 ± 1.97 %)的相对丰度最高，其次是ZraR(17.76±3.32%)和多铜氧化酶(CueO)(12.13±1.91%)(图7C)

图7：恒河含有金属抗性基因的微生物多样性及其相关功能。7A：赋予MRG的细菌门的相对丰度。7B：负责MRG库的细菌属。7C：与每种MRG类型相关的预测功能的空间组成。

9. ARGs的微生物宿主及其相关功能

数据集的分类注释分析用于分析ARGs与微生物分类之间的关联。主要成分包括变形菌门(85.62%)、放线菌门(6.98%)、拟杆菌门(1.2%)和绿弯菌门(1.12%)(图S5A)。大多数Burkholderia和Stenotrophomonas物种是重要的医院感染病原体，并且经常在囊性纤维化患者的呼吸道标本中发现Cupriavidus、Pandoraea和Ralstonia物种。各种人类活动对于这些分类的普遍存在与医院相关的排放、粪便污染和群体沐浴有关。因此，这些发现对于恒河沿岸城市定居点的水质监测和管理具有重要价值。

MGEs是多重抗生素耐药菌的进化和扩散驱动因素。与其他样本相比，在G13DS(110,000)，G18US(125,000)和G18DS(150,000)中观察到了最大的MGE多样性(图S6A)，这表明这些地点存在大量的人为输入，导致更高的水平基因转移。转座酶(70.87±5.80%)是样品中检测到的最主要的MGE，其次是重组酶(15.28±3.04%)和整合酶(7.65±1.14%)(图S6B)。转座子中的转座酶参与抗生素耐药性的传播，这有利于宿主的适应性、物种多样性和生境扩张。然而，当人类病原体获得这些基因时，会危及公共卫生。

10. 噬菌体的多样性和功能

我们使用MG-RAST对数据进行注释，揭示了噬菌体多样性的丰度和相关功能。分析揭示了来自Siphoviridae，Myoviridae和Podoviridae家族的噬菌体，能够攻击抗生素和金属耐受菌，如假单胞菌；布氏杆菌、异黄杆菌、铜绿假单胞菌、潘多菌和拉氏菌。我们使用MG-RAST中的子系统和KEGG数据库对数据集功能注释(见图8A)。针对噬菌体相关蛋白的注释结果表明了宿主-噬菌体关系的强烈存在。有趣的是，我们的研究还发现了与噬菌体相关的裂解活性(溶菌酶、内切酶、N-乙酰基葡萄糖胺酰-L-丙氨酸酰胺酶、内切肽酶)序列的命中率(见图8B)。这些酶可以进一步用于治疗、诊断和生物技术相关应用的生物探索。

图8：恒河噬菌体的多样性和功能。8A:利用MG-RAST预测对宿主噬菌体相关蛋白的功能注释。8B:噬菌体相关溶解盒的功能。

ARGs和MRGs的较高发生率表明，微生物群落长期暴露于人为污染物中，对河流生态系统构成严重威胁。利用宏基因组测序发现了重要的医院相关病原体，如假单胞菌、伯克氏菌和窄养单胞菌，是ARGs和MRGs库的主要潜在分类群。在所有地点丰富的噬菌体多样性可以进一步探索其对恒河不腐特性的生物前景。目前的研究将大大有助于对恒河长期暴露于ARGs和多金属污染的监测/基于风险的评估。这些数据可用于缓解水污染和改善恒河下游营养状况的策略。

参考文献

Samson, Rachel et al. “Spatio-temporal variation of the microbiome and resistome repertoire along an anthropogenically dynamic segment of the Ganges River, India.” The Science of The Total Environment, 2023, 872: 162125.

doi:10.1016/j.scitotenv.2023.162125