英文标题: Spatial transcriptomics reveals niche-specific enrichment and vulnerabilities of radial glial stem-like cells in malignant gliomas

发表时间：2023.02.23

发表期刊：Nature Communications

恶性胶质瘤，包括H3K27M突变型弥漫中线胶质瘤（DMG）和胶质母细胞瘤（GBM），是最常见和致命的原发性脑肿瘤。这些肿瘤治疗失败的主要挑战包括高度异质性和特征性的浸润性生长。

空间转录组技术与新开发的长读长测序技术相结合，可同时揭示基因表达的空间异质性以及由RNA选择性剪接引起的转录本异构体的差异表达。在此项研究中，研究者通过短读长和长读长空间转录组测序技术对DMG和GBM进行分析，以解码生态系统并确定不同胶质瘤生态位中的特定调控程序。

材料：5例DMG、3例IDH野生型GBM、2例IDH突变型GBM及1例癌旁组织。使用10X Visium平台对同一组织切片进行了短读长和长读长空间转录组测序(ST-seq)。

主要研究方法：空间全长转录组测序

测序平台：10X Visium+Nanopore

1、样本的空间信息聚类和肿瘤细胞空间测序单元（spot）的识别

10x Visium空间转录组测序共获得26460个spots，利用CNV分析筛选包含肿瘤细胞的spots用于后续分析。

图1工作流程和样品信息概述

2、胶质瘤生态位特异性转录调控

共鉴别到4种基因表达模块，对应的肿瘤空间结构分别为：模块1-肿瘤核心区（富集正常胶质发生和胶质瘤发生相关的基因）、模块2-富血管区（富集血管生成和内皮细胞相关的基因）、模块3-肿瘤浸润区（富集神经元和突触相关基因）和模块4-缺氧坏死区（富集参与缺氧和应激反应的基因）（图2）。这些分区与病理学特征高度吻合。

图2胶质瘤生态位特异性空间转录调控及其与细胞群落结构的关系

3、神经胶质瘤生态位的RNA异构体多样性

为确定神经胶质瘤细胞分区中RNA异构体的多样性，本研究利用ONT平台对10X Visium生成的空间barcode cDNA进行测序，识别新的转录亚型(图3A)。结果证实了神经胶质瘤生态位中的AS事件。例如，CHI3L1（编码一种分泌糖蛋白YKL-40），与血管生成和胶质瘤进展有关。检测到CHI3L1（编码一种分泌糖蛋白YKL-40，与血管生成和胶质瘤进展有关）的长(CHI3L1-201)和短(CHI3L1-205)亚型，它们在低氧生态位和侵袭生态位中差异富集(图3C-E)。Tomm6 (外线粒体膜转位酶6)的长亚型(Tomm6-202)和短亚型(Tomm6-201)在低氧生态位和侵袭生态位中差异富集(图3G-H)。

图3 长读长空间转录组揭示胶质瘤生态位中RNA异构体的多样性

4、生态系统分析揭示放射状胶质样（RG-like）细胞的生态位特异性富集

研究者确定了每个spot的细胞组成，并计算了不同生态位点的平均细胞丰度(图4A)。这四个生态位中都有相当比例的星形胶质细胞(ACs)，且在侵润性生态位中最为丰富；血管和免疫细胞(周细胞/内皮细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和B细胞)在缺氧和血管生态位中富集；少突胶质细胞前体细胞（OPCs）在肿瘤核心部位最为丰富(图4A)；而在侵袭性生态位中神经元含量最高(图4B)。

有趣的是，在DMG和GBM 中都发现了RG-like细胞群，它们在胶质瘤样本的侵润性生态位中富集，为肿瘤干细胞。

图4 神经胶质瘤生态系统分析

5、RG-like细胞在富含神经元的侵润性生态位中的调控景观

RG-like细胞的分区特异性调控分析显示，OPCs标志物OLIG2、SOX9和细胞周期基因CDK1、MKI67在肿瘤核心区的表达最高，而神经元标志物ZIC1、GABRA1和成熟少突胶质细胞标志物MBP在正常颗粒神经细胞层（GCL_N）的表达最高。颗粒神经细胞层的远端位置（GCL_TI）特异性上调RG标志物TNC、HOPX、PTPRZ1和VIM、星形胶质细胞标志物CLU、LGALS1以及参与迁移和胶质瘤网络形成基因，如CD44、SPARC和GAP43。这些基因统称为GCL_TI特征。1/4的GCL_TI特征基因与RG样细胞的标记基因重叠。这些基因的高表达与TCGA-GBM队列的预后不良相关。

图5 RG-like细胞在富含神经元的侵润性生态位中的调控景观

6、 FAM20C在神经元丰富的微环境中介导RG-like细胞的侵袭性生长

研究者在GCL_TI中上调量最大的10个RG-like细胞表达的基因中，发现了FAM20C。之前研究表明在体外，乳腺癌细胞株中FAM20C的缺失会损害其迁移和侵袭能力。但其在DMG中的作用尚未见报道。FAM20C在神经元含量高的DMG1的GCL_TI中表达最高，在神经胶质瘤样本中，其在侵润区的表达高于肿瘤核心。此外，在TCGA-GBM队列中，FAM20C的高表达与预后不良相关。

通过基因编辑构建突变人神经干细胞系HPT hNSC，并原位移植到免疫缺陷的鼠脑干建立人鼠DMG发生模型。比较FAM20C敲除和野生型HPT hNSC在体外或人与鼠神经元共培养条件下的侵袭、生存以及体内肿瘤形成情况，结果表明FAM20C是调控RG-like细胞在肿瘤微环境中侵润性生长的重要基因(图6)。

图6 FAM20C在富含神经元的微环境中介导 RG-like细胞的侵袭性生长

本研究结合空间转录组技术与长读长测序技术对DMG和GBM样本进行空间分析，确定了恶性脑胶质瘤的空间异质性。DMG中存在RG-like细胞，并在神经元侵润区富集；证实FAM20C是调控RG-like细胞在肿瘤微环境中侵润性生长的重要基因。该结果为未来胶质瘤分区和生态系统的功能研究开辟新途径。