原位捕获技术促使基因表达数据能够定位到组织环境，使我们对复杂生物系统有了更深入的理解。然而，现有的转录组方法无法在空间分辨率水平表征可变剪切和全长序列的异质性。该研究提出了一种探索性方法：空间isoform转录组（SiT），它是基于Nanopore测序表征空间异构体变异和序列异质性的方法。该研究展示了小鼠大脑两个不同区域的空间异构体表达和序列异质性，并鉴定到脑功能相关的多个基因，在空间位置上显示不同的异构体表达。此外，全长序列异质性的探索首次提供了成年小鼠脑内 A-to-I RNA编辑图谱。

文章标题：The spatial landscape of gene expression isoforms in tissue sections

发表期刊：Nucleic Acids Research （IF=19.160）

发表时间：2023.3.17

1. 通过原位捕获和长读长测序实现空间异构体检测

作者将新鲜冷冻组织切片样本固定在带有空间barcode的载玻片上，染色和成像后，使用10x Genomics Visium平台原位捕获mRNA分子，并用barcode和UMI进行标记。然后将获得的全长cDNA文库分成2份，分别进行3’端短读长测序和Nanopore长读长测序（图1A）。基于差异基因进行聚类，以鉴定不同的解剖区域，用作分析区域isoform的标志。

图1 SiT 方法和数据统计

该研究分别展示了小鼠的两个脑区的isoform空间分布：嗅球（MOB）和左半球的两个冠状切片（CBS1，CBS2）。共使用13个PromethION芯片进行测序，产生5.35亿条 reads，三个样本的长reads数据达到了高饱和，CBS1和CBS2的测序饱和率分别为51.6%和62.8%（图1B，C）。使用先前报道的scNaUMI-seq方法将短reads鉴定的空间barcode和UMI分配给Nanopore reads。该方法通过cDNA片段筛选富集全长cDNA，得到近乎全长转录本，使得能够探索剪接和全长isoform的异质性（图1E）。

2. 嗅球区isoform转换

作者使用SiT方法研究MOB的空间isoform分布。在整个组织切片中，鉴定到13,291个不同基因的23,560个参考转录本。基于短reads的聚类分析将切片分为5个解剖区域（图2A）。基于这种无监督聚类，分析区域之间表达不同isoform的基因，共鉴定到36个，其中最显著的是Myl6和Plp1。

图2 SiT 揭示了小鼠嗅球中的isoform区域转换

肌球蛋白轻链6（Myl6），编码六聚体 ATP 酶细胞运动蛋白的非磷酸化碱性轻链成分，已被证明参与未成熟和成熟神经元的神经元迁移和突触重塑。Myl6主要产生两种大小相同的多肽：非肌肉 isoform Myl6-206（Lc17a）和平滑肌 isoform My16-201（Lc17b）。该结果显示，Myl6-201在颗粒细胞层中高表达，而Myl6-206优先在嗅觉神经和二尖瓣细胞层中表达。

蛋白脂蛋白1（Plp1）是一种参与中枢神经系统髓鞘异常相关的严重病理学的基因，它的2种isoform表达具有显著的区域差异，在内部颗粒细胞层表达Plp1-201（PLP） isoform，在嗅觉神经层的外部区域表达截短的Plp1-202（DM20） isoform（图2B，C）。SiT可以鉴定到仅存在于PLP中的35个密码子，并在空间背景下量化PLP/DM20剪接平衡，这种平衡已被证明与Pelizaeus-Merzbacher疾病有关。作者同时使用原位测序（ISS），在另一个个体的组织切片上验证了Myl6和Plp1的isoform表达的区域转换（图2d）。

作者基于先前发表的小鼠嗅球单细胞转录组数据集，使用SPOTlight分析每个spot位点的细胞类型，将颗粒细胞层内的髓鞘形成少突胶质细胞（MyOligo）确定为Plp1标准isoform的主要来源，将嗅觉神经层内的嗅觉鞘细胞（OEC）确定为截短的Plp1 isoform DM20的主要来源（图2E，F）。

3. 冠状脑isoform转换

然后将SiT应用于两个50μm间隔的相邻冠状脑切片（CBS1、CBS2），分别使用3张芯片获得1.74亿条长reads和8张芯片获得2.87亿条长reads。基于短reads基因表达聚类，聚为12个解剖区域（图3a），这与Allen小鼠的脑参考图谱中的区域大致对应（图3B）。且对应spot位点的短reads和长reads基因表达谱的Pearson相关性分别为0.98和0.93（图3C）。

图3 使用两个冠状脑切片评估SiT 的稳健性

作者鉴定了12个解剖区域中具有差异isoform表达的基因。共鉴定到16,899个基因编码的33,097个isoform。其中9,053个基因（53.6%）只表达1个的isoform，7,846个（46.4%）基因在整个组织切片中表达多种isoform（图3D）。在不同的区域，每个基因的isoform数量变化很小，海马体CA3区域的isoform复杂性略高（图3E）。作者在CBS1和CBS2中分别鉴定了126个和166个基因的isoform存在显著的区域转换，并使用ISS验证了其中61个基因的空间isoform表达模式。

作者鉴定到参与脑功能的几个基因的isoform转换（图4A，B）。第一个例子是Snap25，它在下丘脑中表达Snap25-202（Snap25a） isoform，而中脑中主要表达Snap25-201（Snap25b）isoform（图4C，D）。这两种isoform分别是由编码不同的第5个外显子的两个紧密间隔序列产生的，导致两种多肽之间206个氨基酸中有9个发生变化，这种差异已被证明在中枢突触的可塑性中发挥作用。作者使用ISS验证了其空间isoform表达模式（图4E，F）。

图4 SiT 揭示小鼠大脑区域 Snap25 isoform转换

第二个例子是Bin1，它属于Bin-Amphiphysin-Rvs167（BAR）结构域超家族蛋白。Bin1参与膜弯曲的调节，特别是在网格蛋白包被的突触小泡。Bin1基因座已被确定为阿尔茨海默病遗传风险的主要调节因子。该研究显示，Bin1 isoform表达存在显著的区域转换。Bin1-205在中脑和纤维束中表达，而Bin1-201以稀疏模式表达，在同型皮质和海马体齿状回（DG）和CA3区富集。

isoform区域转换的第三个例子是Gnas，它由一个复杂的印迹基因座编码，作为刺激性G蛋白 (Gsα)的α亚基，是环AMP信号通路的重要组成部分。在两个冠状脑切片中，Gnas α-L（Gnas-208）在所有区域高表达，使其成为最丰富的Gnas isoform。低表达 isoform Gnas-S（Gnas-206）主要存在于纤维束中，Gnas-221主要在同型皮质和海马体CA3区表达。

4. SiT揭示小鼠脑的A-to-I RNA编辑图谱

最后，作者研究了RNA腺苷转肌苷（A-to-I）编辑事件，这是哺乳动物转录组中转录序列异质性的主要来源。作者主要调查了具有高测序深度的CBS2数据。通过严格的过滤，鉴定到249,759个纳米孔编辑位点（66.2%）用于下游分析（图5A）。在全局范围内，鉴定到至少一个UMI覆盖的2,730个不同编辑位点的A-to-I RNA编辑率为10.56%。编辑比率显示出不均匀的空间分布（图5b）。且A-to-I编辑酶（腺苷脱氨酶，ADARs）的表达水平与脑区域的编辑比率呈正相关（图5C）。

图5 SiT 揭示小鼠大脑中 A-to-I RNA 编辑的空间变化

作者比较了短reads和长reads测序在鉴定RNA编辑事件方面的潜力，结果显示，长reads比短reads可以鉴定更多的信息（图5D），因为长reads可以研究3’端编辑位点以外的序列异质性。作者鉴定到神经元功能相关的几个关键基因，如Gria2、Grik5、Tmem63b或Blcap存在跨脑区域的编辑变异（图5E）。

AMPA受体（AMPARs）介导大脑中大部分快速兴奋性神经传递，由4个不同的亚基组成。已知Gria2（GluA2）亚基转录本在两个位置进行编辑：位于配体结合结构域中R/G位点，导致更快的脱敏和从脱敏中恢复；位于通道孔内的Q/R位点，这种编辑使AMPAR不可被Ca2+渗透，从而起到影响神经传递的关键作用。该研究鉴定到的编辑R/G位点少于Q/R位点，与之前的结果一致。同时发现R/G编辑位点的区域差异，海马体亚区编辑水平较低，同型皮质的编辑水平较高（图5E）。

该研究使用空间isoform转录组方法，展示了小鼠大脑两个不同区域的空间异构体表达和序列异质性，揭示了Plp1基因在嗅球不同层之间的isoform区域转换，鉴定了与脑功能相关的几个主要基因（Snap25、Bin1、Gnas）的isoform区域转换，并使用原位测序对这些基因进行了验证。该研究还首次提供了成年小鼠脑的A-to-I RNA编辑图谱。

参考文献

Kevin Lebrigand, et al., The spatial landscape of gene expression isoforms in tissue sections, Nucleic Acids Research, 2023,  https://doi.org/10.1093/nar/gkad169