1、胡萝卜T2T基因组组装

该团队使用橙色胡萝卜“Kurodagosun“的高代自交系作为研究材料，基于约35Gb（~80X）的ONT Ultra-long、36Gb（~80X）的PacBio HiFi pass reads进行基因组组装。经由初步组装，剩余3个gap区域，然后使用HIFI reads和ONT 超长reads对gap区域进行填补，最终获得了所有染色体均为0 gap的T2T水平基因组，基因组大小430.40Mb，超过了之前的v2.0版本；另外，该基因组contig N50达到45.71Mb，因此在组装连续性上也远超之前的组装版本。此外，基于Hi-C数据，430.40Mb的序列被挂载到了9条染色体上。对组装结果进行质量评估，组装BUSCO 98.9%，二代比对率99.74%、覆盖率99.97%，QV值53.27，表明了该T2T基因组版本具有较高的组装完整性、一致性和准确性。
 

2、端粒和着丝粒的鉴定

与v2.0进行共线性比较，发现两个基因组版本间存在部分染色体的结构重排，这些结果还表明了该T2T版本填补了之前基因组的很多gap（图1）。此外，一系列的倒位、易位和重复等结构变异被发现。作者还基于重复序列TTAGG进行了端粒预测，结果共有14个端粒区被预测出来，而在2号染色体两端及3、4号染色体的其中一端没有检测到端粒重复序列。基于连续的高密度短串联重复序列和低基因密度特征，该研究进行了着丝粒的预测，9个染色体的着丝粒区域均被预测出来，值得注意的是，这些着丝粒区域中的大多数在之前的基因组版本中都未被组装出来，估计长度在1700Kb-7000Kb之间（表1）。

 

图1 高质量端粒到端粒的胡萝卜基因组组装

表1 胡萝卜T2T基因组着丝粒预测情况


 

3、比较基因组分析

基于包含胡萝卜在内的共12个物种，作者构建了系统发育树来评估分化情况（图2）。在大约27百万年前，胡萝卜与芹菜及其他伞形科植物出现了分化。此外，在胡萝卜中鉴定到了2866个基因家族收缩和638个基因家族扩张，即更多的基因家族发生了收缩，这和芹菜的基因家族收缩扩张情况最为接近；然而，水芹和香菜却有更多的基因家族发生了扩张，有意思的是，其中发生收缩的基因家族主要和植物激素信号转导相关，而扩增基因家族则参与了泛素介导的蛋白水解和胞吞作用。
 

图2 分化时间估计和基因家族扩张/收缩

基于同源基因的同义突变率分析，作者分析胡萝卜可能发生了2次全基因组复制事件（图3）。与芹菜和香菜基因组相比发现，这些物种经历了伞形科植物共享的一次WGT和WGD。这三个伞形科物种中，不同的KS值表明胡萝卜可能最先分化出来，其次才出现了芹菜和香菜。作者又对胡萝卜和芹菜基因组进行了共线性分析，3：3的共线性深度比表明它们经历了相同的WGD事件。

图3 胡萝卜vT2T基因组的WGD和进化分析

4、胡萝卜类胡萝卜素代谢途径

胡萝卜‘Kurodagosun“在发育过程中的类胡萝卜素含量的变化被测量，发现叶黄素,α-胡萝卜素、β-胡萝卜素等的浓度在根发育的各个阶段都能检测到升高。于是，基于胡萝卜T2T基因组数据，该研究重建了影响胡萝卜肉质根颜色的类胡萝卜素代谢途径，共鉴定出65个结构基因，其中有9个基因是胡萝卜T2T基因组版本所特有的（图4）。值得注意的是，共有24个基因属于细胞色素P450基因家族。此外，基于胡萝卜T2T基因组注释到的重复序列，作者筛选到一些与类胡萝卜素合成途径基因重叠的转座子，在PSY、PDS等基因附近发现了不同数量的转座子，且这些转座子涉及到多种类型。最后，作者还比较了这些类胡萝卜素结构基因的转录水平，并通过qPCR对相对表达水平进行了验证，结果发现不同的基因具有多样化的表达趋势和水平。

图4 胡萝卜类胡萝卜素代谢途径