英文标题:  Metabolomics and mass spectrometry imaging reveal the chronic toxicity of indoxacarb to adult zebrafish (Danio rerio) livers

发表时间：2023.03.28

发表期刊：Journal of Hazardous Materials

IF:14.224

农药在农业生产中发挥着重要作用，但由于过度使用，农药已成为有机污染物的重要组成部分之一。为了减少对环境的污染，低毒、高效、环保的农药被提出和推广。其中，茚虫威是一种广泛应用于农业害虫防治的杀虫剂，但其对非目标生物的负面影响尚不清楚。

本研究采用代谢组学和质谱成像(MSI)相结合的方法，旨在评估茚虫威在真实环境中不同浓度下对成年斑马鱼肝脏的暴露效应，有效监测了斑马鱼全身和肝组织中代谢产物的水平和空间分布。综合考虑，茚虫威的毒性可归因于斑马鱼代谢途径的紊乱和解毒能力的降低。这些发现为杀虫剂对水生生物的环境风险评估提供新的见解。

图1 空间分辨代谢组学示意图

主要研究方法：代谢组学+MSI

1、 茚虫威暴露对成年斑马鱼的急性毒性

首先进行了成年斑马鱼对茚虫威的急性毒性实验，表明96 h LC50值95%可信区间分别为3.06mg/L和2.35-3.70mg/L，成年斑马鱼的死亡率呈剂量依赖性和时间依赖性增加。

2、 茚虫威暴露后成年斑马鱼的行为评价

进一步对成年斑马鱼在不同天数的茚虫威暴露后的行为进行评估。结果表明：斑马鱼的游动距离和平均速度在茚虫威暴露后的一定时间均呈下降趋势，斑马鱼在长时间接触茚虫威（例如21天）时表现出显著的差异，与对照组相比，斑马鱼的游动距离和平均速度受到严重抑制。

3、 茚虫威暴露后斑马鱼肝组织的组织病理学研究

肝脏组织病理学测定发现，对照组肝组织形态结构正常，细胞致密排列，细胞质完整，细胞轮廓清晰，暴露组肝脏细胞排列松散，呈现大量的无核细胞(图2)。即使在相对较低的浓度下，长期暴露于茚虫威也可能导致其形态和组织学发生变化。

图2 对照组和暴露组斑马鱼肝脏在400×倍率下的H&E图像

4、 茚虫威暴露对斑马鱼肝脏抗氧化活性的影响

研究茚虫威对斑马鱼肝脏SOD、CAT、GOT、GPT活性的影响，结果表明环境相关浓度0.03mg/L的茚虫威可提高成年斑马鱼肝脏CAT、GOT和GPT活性（图3）。这些酶活结果与茚虫威暴露引起的肝脏组织病理学变化相一致，进一步表明茚虫威暴露可引起斑马鱼肝脏损伤。

图3 0.03mg/L茚虫威暴露后的肝脏SOD、CAT、GOT和GPT等酶活变化

5、 茚虫威暴露28天后斑马鱼肝脏代谢产物的研究

对暴露组和对照组斑马鱼肝脏的代谢谱进行了非靶向代谢组研究。暴露组和对照组在正离子模式下可以完全分离（图4A）,而这些差异在负离子模式下显著扩大，暴露组具有更多的收缩团簇，表明在两组之间代谢特征存在显著差异。表明茚虫威能在很大程度上改变斑马鱼肝脏的代谢谱，这导致茚虫威对斑马鱼具有较高的毒性。

图4 0.03mg/L茚虫威暴露28天对斑马鱼的影响

6、 茚虫威暴露28天后斑马鱼代谢产物和途径的差异

在茚虫威暴露28天后，斑马鱼肝脏中的大多数代谢物呈下降趋势，有机酸、有机氮化合物、黄酮类化合物显著下调。在正离子模式下，差异代谢物主要富集在五种途径中，其中谷胱甘肽代谢和铁死亡受到显著影响（图5B）。在负离子模式下，苯丙氨酸代谢受到的影响最大。具体来说，赖氨酸降解、氨基酸生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和组氨酸代谢以及TCA循环受到影响（图5C）。

图5 茚虫威暴露28天后斑马鱼肝脏的差异代谢产物和KEGG途径

7、 茚虫威暴露后斑马鱼全身组织内源性代谢物和脂质的空间分化

施用农药会影响斑马鱼组织中内源性代谢物的空间分布，从而影响斑马鱼的健康。研究者进一步研究了茚虫威暴露对斑马鱼全身组织中脂质定位的影响。MSI结果显示，暴露于茚虫威后，斑马鱼肝脏内的脂质离子信号受到显著影响。它们在斑马鱼肝组织和全身组织中的含量呈一定的上升或下降趋势。具体来说，甘油三酯（DG）(34:2)、DG(36:2)和甘油三酯(TG)(48:2)的信号强度降低，而lyso-PC (LPC)(18:1)、DG(36:4)、TG(48:1)和TG(50:2)的信号强度升高，这可能与暴露于茚虫威及其代谢有关。MSI揭示了斑马鱼组织内代谢物和脂质的空间分布模式（图6）。

图6 斑马鱼全身组织的MSI

8、 茚虫威暴露的斑马鱼肝脏代谢途径分析

研究者绘制了茚虫威暴露下斑马鱼肝脏中涉及的代谢通路变化：茚虫威抑制斑马鱼肝脏的TCA循环和氨基酸代谢，导致相关代谢产物水平（琥珀酸和α-酮戊二酸、5-羟基-3-吲哚乙酸、L-犬尿氨酸和谷胱甘肽等）显著降低，干扰氨基酸的正常功能（图 7A）。这可能是茚虫威引起斑马鱼肝脏慢性毒性的原因之一。

图7 空间代谢组学水平上涉及TCA循环和氨基酸相关代谢的紊乱代谢途径示意图

本研究联合非靶向代谢组学和MSI方法在代谢水平解析了长期农药暴露对斑马鱼肝脏差异代谢产物和空间分布的影响。在环境相关浓度的茚虫威暴露后，斑马鱼肝脏中氨基酸相关代谢产物的水平会受到显著影响。其中，谷胱甘肽代谢下调可能使斑马鱼肝脏解毒能力降低，进而增加斑马鱼的药物毒性。MSI方法直观显示了茚虫威暴露后代谢产物在斑马鱼全身组织和特定器官水平上的紊乱空间分布，验证了代谢组学的结果。总之，空间代谢组学的新发现将有助于阐明茚虫威在斑马鱼肝脏中的暴露效应，为农药在环境领域的合理使用提供新的视角。