英文标题：Comprehensive map of ribosomal 2’-O-methylation and C/D box snoRNAs in Drosophila melanogaster

发表期刊：Nucleic Acids Research

发表时间：2024.2.26（IF：14.9）

通讯作者：Jean-Yves Roignant，Center for Integrative Genomics, Faculty of Biology and Medicine, University of Lausanne

在核糖体RNA（rRNA）的成熟过程中，它们会经历数百种化学修饰，这些修饰参与rRNA二级结构的正确折叠，从而影响核糖体的功能。rRNA的正确折叠及关键功能区域的2'-O-甲基化（Nm）和假尿嘧啶（Ψ）修饰对其催化活性至关重要，且这些修饰主要由C/D box snoRNA及其相关蛋白复合体介导。C/D box snoRNA通过其反义元件（ASE）精确指导rRNA上的Nm添加。尽管许多生物体中已经发现Nm位点，但其与snoRNA的明确对应关系尚待全面解析。

在本研究中，采用RiboMethSeq(RMS)和DRS技术对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的rRNA Nm位点进行了高分辨率的检测和量化，并构建了一个包含61个Nm位点的综合图谱，这些位点大多与106个表达的C/D box snoRNA相匹配。研究表明，虽然rRNA上的Nm修饰在不同环境压力下总体保持稳定，但也表现出一定的压力特异性变化，提示了潜在的适应性机制。这项工作不仅丰富了对rRNA修饰的理解，还为进一步探究多细胞生物中单个snoRNA在调节rRNA功能及核糖体活动中的具体角色提供了新的视角和研究途径。

Direct RNA seq在本研究中作为核心技术手段，对于全面刻画果蝇rRNA的2'-O-甲基化景观、验证修饰酶的功能、排除假阳性干扰以及深入理解C/D box snoRNA介导的甲基化调控机制均起到了决定性作用。

图1 黑腹果蝇rRNANm和C/D box snoRNA的综合图谱

研究结果

1. 黑腹果蝇rRNA上的Nm位点鉴定

本研究通过构建RMS文库，对果蝇S2R+细胞rRNA的Nm位点进行了精确鉴定。首先，通过提取对照组（CTR）和Fibrillarin敲减（Fib-KD）条件下S2R+细胞的总RNA，利用碱性环境下Nm核苷酸的抗剪切特性，并经过组合评分MEAN > 0.92和scoreA2 > 0.5 的严格筛选，鉴定了183个潜在Nm位点。之后通过比较对照组与体外转录无甲基化rRNA（IVTs）的MethScore，筛选出了92个候选Nm位点。

进一步依据Fib-KD后MethScore显著降低的标准，最终确定了57个高度可信的Nm位点，这些位点的甲基化水平受Fibrillarin的影响显著。剩余的35个候选位点中，14个位点因其MethScore较高而被预测可能与C/D box snoRNA互补。在这14个位点中，有3个确实与已知或预测的snoRNA指导序列互补，另有1个位点在不同物种间高度保守，这4个位点加上之前的57个构成了61个高置信度Nm位点。

图2 黑腹果蝇Nm位点鉴定及分析

2. 使用纳米孔测序对Nm位点进行正交验证

为了提高rRNA Nm位点检测的准确性和完整性，本研究结合RMS分析结果，采用直接DRS技术进行验证，对Fibrillarin敲减(Fib-KD)样本及对照样本进行DRS测序,发现了53个差异显著的区域，其中40个区域与RMS鉴定出的42个依赖于Fib蛋白的Nm位点以及3个不依赖Fib蛋白的Nm位点相吻合。在对RMS已知位点进行DRS验证时，最终除了de novo发现的45个Nm位点之外，又成功验证了10个位点，这意味着95%依赖于Fib蛋白的RMS位点通过DRS得到了验证。

综上所述，尽管并非所有通过RMS鉴定出的Nm位点都能通过DRS de novo检测发现，但几乎全部依赖于Fib蛋白的RMS位点均可经纳米孔测序得到有效验证，这有力地证明了纳米孔测序技术在确认rRNA Nm修饰方面的可靠性和有效性。

图3 使用Direct RNA测序对Nm位点进行正交验证

3. 验证C/D box snoRNA表达并预测Nm靶点

本研究应用TGIRT-seq技术对果蝇的不同组织（S2R+细胞、卵巢和头部）进行了全转录组测序，在所测组织中，共鉴定了106个已表达的snoRNAs（包括新预测的一个候选snoRNA）。分析显示，已表达的snoRNAs在基因组分布上有明显特点，大部分位于蛋白质编码基因或lncRNA内含子中，而基因间区的snoRNAs表达水平较高。snoRNAs的表达水平与它们所定位的基因区域以及它们所修饰的rRNA特定类型有关，尤其是负责修饰28S rRNA的 snoRNAs表达更强，而针对2个Nm位点的snoRNAs表达较低。

通过结合预测工具和RMS/TGIRT-seq数据，研究团队在大多数表达的C/D box snoRNAs（106个中的96个）中成功预测了至少一个可信Nm位点，并对32个snoRNAs预测了新的靶点，同时也修正了5个snoRNAs靶点。最终，总共对61个Nm位点中的58个分配了至少一个snoRNA，还新增了33个snoRNAs与rRNA相互作用的预测。总之，这项研究不仅验证和完善了果蝇中snoRNAs的表达谱，而且加深了对其作用机制的理解，特别是snoRNAs在rRNA修饰过程中的作用。

图4 C/D box snoRNA表达的验证和Nm靶点预测

4. rRNA Nm 水平在应激条件下相对稳定

本研究通过RMS技术，探究了黑腹果蝇在面对不同环境应激时，其rRNA Nm修饰是否会发生动态变化。首先，研究了暴露于氧化应激源百草枯长达8天的雌性果蝇，发现果蝇rRNA的Nm修饰水平基本保持不变，仅有少数位点如28S rRNA的ψm3454表现出轻微的甲基化减少。尽管有些位点在营养缺乏条件下与对照组之间存在显著差异，但总体上Nm水平依旧保持稳定，仅28S-Gm3324和18S-Am469显示出0.05单位的低甲基化现象。最后，通过将果蝇分别置于不同温度下生长，发现18个位点在不同温度下显示出差异性Nm甲基化，其中28S-Gm789、28S-Cm3422和18S-Cm1303的甲基化变化最为显著，表现为在高温下Nm水平较高，在低温下则较低。

总结来说，实验数据显示果蝇rRNA的Nm修饰具有很高的稳定性，对外界环境应激反应相对较小，但也显示出特定压力类型（如温度变化）下存在一定的可调性，即便如此，变化的程度依然有限。

图5  rRNA Nm 水平在应激条件下相对稳定

本研究首次运用了RMS和DRS两种互补技术，全面绘制了黑腹果蝇rRNA中的Nm图谱，并借助全转录组测序手段关联了这些位点与其相应的C/D box snoRNA。研究过程中新确定了61个Nm位点，其中55个位点经两种测序技术共同验证。此外，研究团队还确认了106个C/D box snoRNAs的表达，并对其中31个snoRNAs提出了新的或替代的rRNA Nm靶标的预测。

在对应激条件下rRNA甲基化水平的比较分析中，研究发现甲基化水平虽有轻微变化，但总体表现出稳定的特性，意味着在果蝇体内这种修饰具有较强的稳定性。这项工作为深入探究snoRNA介导的Nm如何调控整个生物体内的翻译过程以及蛋白质稳态提供了重要的理论依据和数据支持。

参考文献：

Sklias, A., et al. Comprehensive map of ribosomal 2'-O-methylation and C/D box snoRNAs in Drosophila melanogaster. Nucleic acids research, 2024.