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项目文章|野生稻单倍型T2T基因组解析和染色体片段置换系助力野生稻基因鉴定

 

近日,中国农业科学院作物科学研究所野生稻种质资源保护与利用课题组杨庆文研究员、乔卫华研究员,与北京大学现代农业研究院何航研究员课题组合作,在国际权威期刊Nature Communications(影响因子16.6,中科院一区Top)发表了题为“Haplotype-resolved gapless genome assembly and chromosome segment substitution lines facilitated gene identification in wild rice”的研究论文。本研究首次组装了野生水稻的单倍型T2T参考基因组,构建两套覆盖野生稻全基因组的染色体片段置换系(CSSL),建立一个能够高通量鉴定发掘野生稻优异基因的平台。通过大量的QTL定位,设计案例,验证了该平台用于发掘野生稻基因的高效性,同时鉴定来自野生稻的耐盐与抗稻瘟病基因。本研究构建的参考基因组和CSSL群体将加速野生水稻功能基因组学研究和基因组能力的抗逆性改善。贝纳基因参与了本研究Nanopore超长测序工作。

 

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 研究背景 

 

栽培稻(Oryza sativa L.),起源于其野生祖先——普通野生稻(Oryza rufipogon),如今已是全球过半数人口的主食粮,占据粮食作物的重要位置。然而,水稻历经驯化与品种选育的历程,伴随着遗传多样性的大幅度缩减,导致诸多有利性状,诸如非生物逆境耐受性和生物逆境抵抗力等,遭受减退或消失。野生稻作为水稻遗传改良的关键资源,蕴藏丰富宝藏,携带着许多在驯化期间遗失或减弱的优良基因。挑战在于,野生稻的基因组高度杂合,长期以来阻碍了高质量参考基因组的构建,迫切需要建立精确的野生稻单倍体参考基因组,借以深入挖掘和利用这份宝贵的遗传宝库。

 

样品选择

 

研究团队采集了来自全国各地的1000多份来自其原生环境的野生稻,从中选择了具有高抗逆性、抗稻瘟病菌、高耐盐性的编号为Y476的野生稻作为样本。

 

研究内容

 

研究团队通过Hi-C、BioNano、Nanopore和HiFi数据,进行基因组组装。首先使用HiFi和ONT数据进行了初步组装,生成了contig N50长度为33.8 Mb的初步版本,随后进行校正和gap填补,并使用Bionano光学图谱和Hi-C数据对基因组进行验证,最终,得到了一个由12条染色体组成的无gap的Y476野生稻基因组,Contig N50为33.8 Mb,BUSCO完整性评估为98.8%,鉴定了22个端粒,预测了12个着丝粒。随后研究人员使用Hifiasm进行分型组装,借助Hi-C数据组装得到了Hap1(411.1 Mb)和Hap2(411.9 Mb)两个单倍型基因组。

 

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图1 Y476基因组与之前发表的野生水稻和栽培水稻基因组组装物的比较

 

研究团队分别以籼稻‘9311’和粳稻‘日本晴’为受体亲本,构建以Y476为供体亲本的染色体片段置换系(Chromosome Segment Substitution Lines, CSSLs)。对两套置换系群体分别进行了遗传结构分析,高世代的9311/CSSL群体有近一半为单片段置换系,低世代的日本晴/CSSL群体覆盖Y476全基因组。

 

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图2两组CSSLs替换片段的基因型和频率

 

随后,研究团队利用获得的参考基因组和构建的CSSL群体,对农艺性状、生物胁迫和非生物胁迫相关的QTLs进行鉴定。通过对CSSL群体进行表型和基因组的关联分析,研究人员能够追踪特定染色体片段的来源和遗传背景,并将其与表型数据相结合,确定与目标性状相关的QTLs。最终,研究团队鉴定出了254个与农艺性状、抗逆性相关的QTLs。这些QTLs代表了野生稻Y476中与重要性状和抗逆性相关的遗传变异区域。

 

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图3 农艺性状相关qtl的鉴定与分析

 

研究团队通过对野生稻Y476和栽培稻之间的差异研究,注意到一个与稻瘟病抗性相关的受体激酶基因LOC_Os07g35680,通过比较野生稻Y476和栽培稻的基因组序列,确定这个基因在野生稻中的特定等位基因与稻瘟病抗性相关。研究团队在栽培稻9311 CSSL群体中筛选出近等基因系,利用CRISPR/Cas9技术、转录组学数据、定量PCR验证、基因敲除以及病原菌感染实验等,验证了野生稻Y476等位基因参与了OsMADS26介导的水稻稻瘟病抗性。

 

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图4 LOC_Os07g35680在Nip和Y476中的序列变异情况比较

 

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图5实时荧光定量PCR显示4个稻瘟病基因在栽培稻和野生稻中的表达模式

 

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图6 LOC_Os07g35680的敲除突变体(N154-KO)的稻瘟病抗性显著降低

 

 


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