近日，南京医科大学附属妇产医院（南京市妇幼保健院）产前诊断中心胡平研究员在国际权威期刊Journal of Translational Medicine（影响因子7.4）发表了题为“Comprehensive genetic analysis of facioscapulohumeral muscular dystrophy by Nanopore long-read whole-genome sequencing”的研究论文。

本研究提出一种基于ONT测序的面肩肱骨肌营养不良症（Facioscapulohumeral muscular dystrophy，FSHD）检测方法，可以区分4q35和10q26 D4Z4重复区域，确定4qA和4qB单倍型，识别致病的D4Z4单元收缩，检测DUX4区域的甲基化状态，同时发掘FSHD2相关的基因突变。

研究团队使用这种新的检测方法对29个样本（16例患病13例健康）进行了分析，并将结果与光学基因组制图（OGM）、亚硫酸盐测序（BSS）和全外显子组测序（WES）的检测结果进行了比较。诊断结果表明，该方法相较于传统方法在诊断正确率上具有较高的一致性，对同源区域、单倍型、致病的D4Z4 单元收缩、甲基化改变和基因突变方面的检测具有额外的优势。贝纳基因参与了本研究Nanopore超长测序工作。

面肩肱骨肌营养不良症（FSHD）是一种常染色体显性神经肌肉疾病，主要特征是面部、肩胛带和上肢骨骼肌肉的进行性非对称性减弱。它被分为两个亚型：FSHD1和FSHD2。

FSHD1是最常见的亚型，约占FSHD病例的95%，其特征是4q35区域D4Z4重复单位（RU）异常收缩，使得DUX4蛋白得以表达而对肌肉产生毒性作用。而FSHD2约占FSHD病例的5%，是由于表观遗传修饰基因SMCHD1、DNMT3B或LRIF1的突变引起的。

FSHD的传统遗传学诊断方法需要确认是否存在致病性等位基因型、确定D4Z4重复长度、并检测无D4Z4重复收缩的患者的基因组甲基化状态。传统方法是使用Southern印迹法检测，检测耗时，不适合大规模的临床应用。而且FSHD的致病基因序列长度长且重复性高，致病和非致病等位基因之间的序列差异有限，因此对FSHD进行遗传分析困难，因此急需开发新的方法。

FSHD检测方法workflow

参考基因组中4q35 D4Z4重复区示意图

研究团队通过分析所有的4qA单倍型等位基因的DUX4上游区域和基因体区域的平均甲基化水平，发现FSHD患者的DUX4上游区域的平均甲基化水平为35.50%，而对照组为66.62%；DUX4基因体区域的平均甲基化水平为44.21%，而对照组为72.37%，病例组和对照组在DUX4基因的甲基化水平上存在显著差异。并将其与既往文献报道用作FSHD指标的10个CpG甲基化位点的BSS结果进行比较。结果显示，DUX4上游区域和基因体区域的平均甲基化水平与患病存在显著相关性，因此DUX4上游区域和基因体区域的平均甲基化水平可以用于区分病例和对照组。

DUX4上游区域和基因体区域的平均甲基化水平

比较病例组和对照组中的甲基化水平

当同时存在致病和非致病的4qA等位基因时，传统的双重限制性酶消化与测序（BBS）方法由于无法区分两个单倍型，会导致甲基化被高估。研究团队采用ONT测序，可以精准检测每个测序读取的等位基因型、D4Z4 RU数和甲基化状态，从而实现对每个读取的精确甲基化评估。

研究结果表明，在样本中存在致病和非致病的4qA等位基因，使用ONT方法可以准确计算每个基因的甲基化水平，依此揭示致病和非致病等位基因之间的显著差异。

4qA单倍型的等位基因特异性甲基化分析