英文标题：mEnrich-seq: methylation-guided enrichment sequencing of bacterial taxa of interest from microbiome

中文标题：mEnrich-seq——对微生物组中感兴趣的细菌的甲基化引导富集的测序

发表期刊：Nature Methods

影响因子：48

发表时间：2024年01月

作者及单位：房刚团队，美国纽约西奈山医学院

图1 mEnrich-seq的工作流程及应用思路

a、 mEnrich-seq工作流。
1.用g-TUBE将宏基因组DNA样品剪切至目标片段大小；2.连接barcode和接头；3.用一个或多个RE（甲基化敏感限制酶，绿色剪刀）处理DNA分子，这些RE切割非甲基化基序位点（绿色圆圈），留下完整的甲基化基序列（填充的绿点）；4.纯化回收高分子量的DNA分子；5.PCR扩增；6.文库制备后测序。
b、 使用具有不同RE的mEnrich-seq来检查来自同一微生物组样本的不同细菌分类群。

1. 基于甲基化富集感兴趣的细菌类群

图2 mEnrich-seq的验证

mEnrich-seq将大肠杆菌（目标菌）的测序reads比例从0.91%-1.20%大幅提升到70.75%-71.41%（图a），富集效率增加约70倍（图b）；富集数据对两个模拟样本的大肠杆菌基因组的覆盖度达到99.96%以上（图c）。该结果，有效展示了在模拟样本中mEnrich-seq对目标菌的较高的富集效率。

图2 mEnrich-seq的验证

mEnrich-seq结果显示，3.98%-4.12%的reads源自淋病奈瑟菌背景菌，90%以上此类reads无GATC位点，能耐受DpnII酶切和PCR扩增；约5%的reads含与淋病奈瑟菌甲基化基序GGTG6mA重叠的GATC位点，避免了DpnII消化；余下部分可能是由SNPs或测序误差导致（图2d）。

在与人基因组比对的reads中（图2e），多数具有GATC位点的reads位于富含简单序列重复区域，这些区域易形成二级结构，不利于DpnII酶的切割。

图2 mEnrich-seq的验证

对尿路感染患者的三个尿液样本（UTI-1、2、3）的mEnrich序列分析，三个样本的大肠杆菌读数都显著增加：UTI-1的8.7倍（从5.88%增加到51.14%），UTI-2的116.8倍（从0.77%增加到90.00%），UTI-3的3.8倍（从24.79%增加到93.59%）（图2f、2g）。

图2 mEnrich-seq的验证

本研究还根据与大肠杆菌分离株的从头组装基因组的比较，从富集测序中回收的大肠杆菌基因组的完整性方面评估了mEnrich-seq。在所有三个样本中，mEnrich-seq reads对大肠杆菌基因组的覆盖均超过99.97%（图2h）。

2. 富集肠道菌群中的A. muciniphila

图3 mEnrich-seq富集肠道菌群中的A. muciniphila

将mEnrich-seq与RE-XapI（消化非甲基化RAATTY位点）一起应用，以耗尽背景DNA并从粪便微生物组中富集A.muciniphila。研究结果显示，GUT-1中A.mucinipila的reads增加了20.0倍（从0.48%到9.59%），GUT-2增加了27.2倍（从0.52到14.16%），GUT-3增加了18.3倍（从1.52%到27.88%）（图3a、3b）。

图3 mEnrich-seq富集肠道菌群中的A. muciniphila

mEnrich-seq reads 对粘球菌基因组的覆盖度达到99.7%以上（图3c），对于A.muciniphila，mEnrich-seq reads与参考基因组的RAATTY频率相当（图3d），这与其基因组上甲基化RA6mATTY基序的富集一致。相反，RAATTY在双歧杆菌、产气荚膜梭菌和长肠杆菌中的频率较低，这三个物种的mEnrich-seq reads进一步降低（图3d）。

3. 低丰度菌的选择性测序

图4 基于新发现甲基化基序的菌进行富集

前面展示了mEnrich-seq对已知甲基化基序的菌的富集效果。接下来以Denovo甲基化基序为基础（图4a），对成人粪便微生物样本（GUT-5）中低丰度菌进行富集，获得了比较理想的富集结果：对A.finegoldii H10的富集达8.7倍（从1.12%到9.73%），对B.ovatus C6的富集达3.1倍（从1.62到5.05%），对B.longum F12的富集达8.7倍（从1.17%到10.17%），对B.longum D10的富集达7倍（从0.32%到2.24%）。

特别的是，D.longicatena和B.intestinihomei共享甲基化基序G6mATGC（反向链GC6mATC），用SfaNI作为RE的mEnrich-seq分别提供了D.longicatena（从0.39%到17.10%）和B.intestinihomei（从0.71%到21.34%）的43.8倍和30倍的富集效果（图4b）。

图4 基于新发现甲基化基序的菌进行富集

将SfaNI（靶向GATGC）和另外五个靶向CTNNAG基序的RE结合到mEnrich-seq测定中，实现了对B.intestinihomei 85倍的富集（从0.71%到60.47%）效率，表明mEnrich-seq与靶向多个基序的REs的组合可以极大地提高特定菌株的富集效率（图4b、4i）

进一步分析成人粪便样本GUT-5和GUT-6，并将mEnrich-seq组装的几个目标物种的基因组与标准宏基因组测序进行比较，发现与标准宏基因组测序相比，mEnrich-seq显著改善了基因组组装（图4j）。

4. mEnrich-seq的普适性评估

图5 mEnrich-seq的普适性

对4601株细菌进行分析发现平均每个细菌甲基组中有三个甲基化基序（图5a），基序中非变性碱基的数量从2个到9个不等，大多在4个到8个之间（图5b）。

图5 mEnrich-seq的普适性

对4601个已知甲基组的细菌菌株系统发育树分析，发现其中3130个菌株至少含一个甲基化基序，具有广泛的分类多样性（图5c），且至少含有一个甲基化基序的菌种占本分析中菌株物种的54.78%。一些RE具有非常广泛的用途，因为它们的靶基序在大量细菌基因组中被甲基化（图5d、5e）。

参考文献：

Cao, L., Kong, Y., Fan, Y. et al. mEnrich-seq: methylation-guided enrichment sequencing of bacterial taxa of interest from microbiome. Nat Methods 21, 236–246 (2024).