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NAT PLANTS详解|m6A修饰反馈调控植物激素ABA信号感知新机制的发现—Direct RNA测序在m6A研究中的应用

 
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英文标题:N6-methyladenosine-mediated feedback regulation of abscisic acid perception via phase-separated ECT8 condensates in Arabidopsis

 

发表期刊:Nature Plants

发表时间:2024年3月

因子:18.0

 

 研究介绍 

 

6-甲基腺苷 (N6-Methyladenosine, m6A) 是真核生物mRNA中含量最丰富的内部修饰,可在植物生长发育及胁迫响应中发挥着重要作用。然而,植物如何识别和利用这种化学修饰在逆境条件下迅速调整其生长的机理至今尚不清楚。

 

已有研究表明,m6A修饰与植物激素脱落酸(ABA)信号传导有关,而ABA信号转导主要参与植物对非生物胁迫的防御反应。在干旱或高盐等非生物胁迫下,ABA迅速积累,并被ABA受体PYR/PYL家族蛋白感知,其可竞争性结合共受体PP2C蛋白,从而解除PP2C蛋白对ABA信号途径中关键的正调控因子SnRK2s激酶的抑制作用。释放的SnRK2s便可以激活一系列ABA信号途径的响应因子,进而帮助植物抵抗逆境。

 

本研究发现m6A修饰及其识别蛋白ECT8可以共同作为ABA信号负反馈调控的关键因素。ECT8通过液-液相分离形成应激颗粒,介导m6A修饰隔离ABA受体mRNA,进而负向调节ABA感知,由此揭示m6A修饰反馈调控植物激素ABA信号感知的新机制。

 

在本研究中,作者借助Nanopore Direct RNA测序可从单碱基水平鉴定m6A等RNA甲基化修饰位点这一优势,通过Direct RNA测序,对不同ABA处理条件下应激颗粒中mRNA m6A修饰特征及修饰差异进行分析,明确了ECT8对应激颗粒中m6A修饰mRNA的动态调控作用。

 

 研究结果 

 

1. ECT8负调控ABA的信号转导

为探究m6A识别蛋白在ABA介导的植物胁迫反应中的作用(图1a),使用公共数据库中的RNA-seq数据,分析m6A识别蛋白基因在ABA处理和非生物胁迫下拟南芥的表达模式,结果显示ABA处理下ECT8的表达显著上调,通过RT-qPCR也进一步验证了ABA信号确实可以促进ECT8的表达。为了研究ECT8在ABA信号传导中的生物学功能,筛选分离得到2个ECT8突变株(ECT8-1ECT8-2)并检测其在添加ABA培养基上的生长情况,结果显示在添加ABA的情况下,两个ect8突变株的幼苗子叶绿化率均低于野生型,(图1b-c),进一步的耐旱性测试显示其抗旱表现优于野生型(图1d-e)。此外,在ABA处理下,ect8突变株中ABI5、RD29A、RD29B等ABA应答基因的表达水平显著高于野生型(图1f)。由此表明,ECT8在ABA信号转导过程中起着负调控作用。

 

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图1:ECT8 影响 ABA 信号转导

 

2. ABA诱导ECT8形成液滴状凝聚体

进一步检测ABA处理和未处理情况下,ECT8-GFP在ect8-1 gECT8-GFP根尖细胞中的亚细胞定位,结果显示ECT8-GFP在细胞质中呈弥散性分布,而ABA显著诱导了ECT8-GFP在细胞质中聚集形成颗粒状凝聚体(图2a),这表明ABA可以诱导促进ECT8形成凝聚体。此外,相交的ECT8-GFP凝聚物可以在细胞质中快速融合成颗粒,表明ECT8-GFP凝聚物具有液滴特征(图2b)。对ect8-1 gECT8-GFP根部进行FRAP荧光漂白实验(图2c-d),发现在这两种情况下,ECT8-GFP从未漂白区域迅速重新分布到漂白区域,证实了体内ECT8-GFP凝聚物呈现液滴状。

 

3. ECT8的相分离依赖其N端的IDR2结构域

液-液相分离(LLPS)通常发生在含有内在无序区域(IDRs)的蛋白质中,而ECT8蛋白包含3个IDRs结构域(IDR1-3)。为确定ECT8相分离的主要作用结构域,将不同截短形态的ECT8进行原核表达实验,结果显示ECT8的N端(包含IDR1和IDR2)在PEG-8000环境下可形成液滴。随后分别移除单个IDR结构域片段,结果显示只有缺少IDR2片段的ECT8(ECT8ΔIDR2)无法形成液滴。FRAP实验也证实仅IDR2本身便足以使得ECT8形成液滴。

 

为了明确ECT8相分离的生物学功能,构建缺乏IDR2结构域的转基因植株((gECT8ΔIDR2–GFP),结果显示,gECT8ΔIDR2–GFP对ABA高度敏感(图2e-f),表明缺乏IDR2的ECT8在ABA信号转导中功能受损。此外,甘露醇处理后gECT8ΔIDR2–GFP并未在根尖细胞内形成类似液滴状颗粒的凝聚物(图2g)。综上表明,IDR2介导的ECT8相分离对于ECT8在ABA信

号转导的功能发挥至关重要。

 

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图2:IDR2赋予的ECT8相分离特性对于ABA信号转导中的ECT8功能发挥至关重要

 

4. ABA诱导形成的ECT8凝聚物定位于应激颗粒(SGs)中

通过免疫共沉淀(Co-IP)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测鉴定ABA处理下ECT8蛋白相互作用的组分,结果显示这些组分富含一些已知的应激颗粒(Stress granule,SGs)相关蛋白,表明ABA响应条件下,细胞质中的ECT8凝聚物可能与SGs有关。共表达定位实验证实ABA诱导产生的ECT8凝聚物与SGs核心调控蛋白Rbp47b可发生共定位(图2h)。综上说明,ABA诱导产生的ECT8凝聚物定位于SGs中。

 

5. m6A结合对于ECT8在响应ABA时的相分离至关重要

已有研究表明,人类YTH结构域的蛋白质可以通过与m6A修饰的RNA结合进而促进相分离。基于此,作者探究了拟南芥中ABA诱导的ECT8凝聚相分离过程是否受到m6A结合能力的影响。对ECT8的YTH结构域内两个保守色氨酸残基进行改造,生成了一个异构体mECT8。LC-MS/MS检测和斑点杂交实验发现,只有未改造的ECT8能够特异性地结合含有m6A修饰的RNA(图3a),表明YTH结构域中两个必需色氨酸残基的ECT8确实具有体外结合m6A的功能,这可能对ABA诱导的ECT8凝聚物至关重要。

 

用带有YTH结构域中W343A/W404A突变的gmECT8-GFP转换ect8-1探究m6A结合能力对ECT8功能的影响。体内RNA免疫共沉淀(RIP)测定结合LC-MS/MS检测和斑点杂交均表明ECT8依赖于其C末端YTH结构域的保守氨基酸残基实现与m6A修饰mRNA的结合(图3b)。当保守残基被改变时,ECT8的m6A结合能力增强,在干旱胁迫下的存活率提高,同时ABA相应的表型恢复功能出现丧失(图3c-d)。此外,gmECT8-GFP在ABA和甘露醇处理下很难形成胞质凝聚物(图3e-f)。综上表明ECT8的m6A结合能力对其液-液相分离及其在ABA信号转导中的作用至关重要。

 

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图3:ECT8的相分离及其在ABA信号传导中的作用取决于其m6A结合能力

 

6. ECT8选择性的富集m6A修饰的mRNA至应激颗粒(SGs)中

由于ABA诱导的ECT8凝聚物与SGs关系密切,且依赖于ECT8对m6A的结合能力,推测ECT8可能在ABA作用下引导含有m6A修饰的mRNAs富集于SGs中。通过斑点杂交和LC-MS/MS检测比较ABA处理下野生型和ect8-1突变株中mRNA的m6A水平发现,相比于野生型,ect8-1突变株中富集于SGs的mRNA m6A水平显著降低(图4a),然而突变株与野生型的mRNA整体m6A水平相近,表明ECT8在ABA处理后对m6A修饰mRNA进入SGs过程有促进作用。

 

为明确ECT8富集m6A修饰的mRNAs进入SGs中的具体机制,对ABA处理后的ect8-1突变株和野生型幼苗进行Direct RNA测序,以探究SGs中富集mRNA的m6A修饰特征及不同处理间的修饰差异。结果显示,与前述实验结果一致,突变株幼苗中SGs中富集mRNA的m6A修饰水平显著低于野生型幼苗(图4b),其中6626个位点呈现低甲基化状态(图4c),并且突变株中低甲基化的m6A位点在转录本的终止密码子和3’UTR区域高度富集(图4d)。此外,大多数低甲基化的m6A修饰位点与富集在ect8-1 SGs中的基因与m6A-seq鉴定结果一致(图4e)。

 

进一步分析这些低甲基化转录本的表达水平,结果显示在ect8-1中,低甲基化转录本的总体表达量显著低于非低甲基化转录本(图4f),这表明ECT8对m6A修饰mRNA的富集会增加SGs中这些转录本的丰度。GO富集分析显示,ect8-1 SGs中的低甲基化和下调基因富集到各种代谢过程和应激反应。综上表明,ECT8选择性富集m6A修饰转录本至SGs中,并在ABA响应中影响其表达丰度。

 

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图4:ECT8选择性的富集m6A修饰的mRNA至应激颗粒(SGs)中

 

7. PYL7 RNA可在ABA处理下被ECT8富集于SGs中

ect8-1 SGs中,低甲基化和下调的mRNA包括PYL7,其可编码ABA受体并且高亲和力结合ABA以促进抗旱性。PYL7转录本在3’UTR中含有一个高置信度的m6A位点(ATTTm6AACGCA)(图5a)。通过m6A-IP-qPCR验证发现,与外源ABA处理的野生型相比,ect8-1富集在SGs中的PYL7的m6A水平降低(图5b),同时转录本表达也显著降低(图5c)。这些结果表明,在ABA作用下,ECT8促进SGs中m6A修饰的PYL7转录本的积累。

 

此外,在ABA响应过程中,ect8-1中SGs内PYL7转录本的低m6A修饰水平及其表达量降低,仅在同时具有相分离和m6A结合能力的ECT8-GFP中恢复至正常水平,表明ECT8调控SGs中PYL7的功能同时依赖其两方面的特性:相分离能力和m6A识别结合能力。

 

RIP-qPCR实验结果显示ECT8不论是否经过ABA处理都能与PYL7转录本结合,并在ABA处理时结合增强(图5e)。单分子RNA FISH实验结果显示,未经ABA处理时,PYL7转录本在ect8-1 gECT8-GFP根尖细胞中分散分布,而在ABA处理后,PYL7转录本则集中于SGs,并与ECT8-GFP发生明确的空间共定位。以上表明,ECT8可将m6A修饰的PYL7转录本富集于SGs中以响应ABA。

 

8. PYL7转录本在SGs中的隔离限制PYL7蛋白积累

鉴于SGs中mRNA的隔离对胁迫条件下翻译输出的影响,进一步探究ECT8介导m6A修饰的PYL7 mRNA进入SGs是否影响ABA处理后的PYL7蛋白含量。通过在野生型背景下表达PYL7基因的全长结构和GFP标签并与ect8-1的杂交后代进行比较,发现ABA处理时,ect8-1PYL7-GFP蛋白水平显著高于野生型,而在对照处理下两者差异不大(图5g)。此外,通过CaMV 35S启动子过表达PYL7同样导致与ect8-1类似的ABA超敏和干旱抵抗力增强表型,进一步证实 ECT8 将m6A修饰的PYL7转录本富集于SG中限制了PYL7蛋白积累,从而赋予ABA信号传导负反馈调节。

 

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图5:ECT8 的相分离将 PYL7 RNA 隔离在 SG 中,并影响 ABA 响应的 PYL7 蛋白水平

 

 研究总结 

 

综上所述,该研究提出并阐明了m6A修饰及其识别蛋白ECT8通过液-液相分离感受细胞内ABA浓度的变化,并隔离ABA受体mRNA,从而实现反馈调控ABA信号感知和逆境胁迫响应的新机制。该研究揭示了应激颗粒和m6A修饰协同调控植物逆境响应的重要作用,为改良农作物耐逆性提供了新的思路。

 

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图6:拟南芥中 ECT8 通过 m6A 介导的 PYL7 隔离对 ABA 信号传导的反馈调节机制

 

参考文献:

Wu X, Su T, Zhang S, et al. N6-methyladenosine-mediated feedback regulation of abscisic acid perception via phase-separated ECT8 condensates in Arabidopsis[J]. Nature Plants, 2024: 1-14.

 

 

 

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