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癌症发展进程中m6A修饰与可变剪接之间的相互作用(1.2万字长文综述)

 

Direct RNA测序(Direct RNA sequencing, DRS)是一种新兴的测序技术,它无需先转换成cDNA,直接读取RNA分子的核苷酸序列、RNA修饰及Poly(A)尾等信息。DRS技术可以准确且无偏好地鉴定可变剪切,同时,不依赖抗体,直接检测RNA上的单碱基分辨率的m6A修饰。因此DRS技术已成为解析癌症发展进程中m6A修饰与可变剪接之间复杂相互作用的强大工具。

 

文献信息

 

本文是2023年10月份发表在《Clinical and Translational Medicine》上的有关癌症病程中m6A修饰与可变剪接之间相互作用的综述文章。

 

文献信息如下所示:

Zhu ZM, et al. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clinical and Translational Medicine. 2023

 

摘要

 

N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物中最为普遍的内部mRNA修饰,它由m6A甲基转移酶添加,通过m6A去甲基化酶去除,并被m6A结合蛋白识别。这种修饰极大地影响了RNA代谢的各种方面,并在细胞及生理过程中发挥着关键作用。

 

前体mRNA(pre-mRNA)的选择性剪接(亦称可变剪接,Alternative splicing,AS)过程,即从多外显子基因产生多种剪接异构体的过程,对哺乳动物中的蛋白质多样性有着重要贡献。此外,已经证实m6A修饰与可变剪接之间存在相互作用,即pre-mRNA上的m6A修饰发挥着调控作用。m6A修饰通过招募能够调节可变剪接的RNA结合蛋白(RBPs),或是直接影响RBPs与其目标RNA之间的相互作用,从而调整可变剪接模式。相反,可变剪接也能影响mRNA上m6A修饰的添加或识别。m6A修饰的整合拓宽了癌症治疗的策略范围,而可变剪接则为理解m6A甲基化在癌症发生和进展中的机制性作用提供了新的视角。

 

前言

 

真核生物的RNA含有超过170种化学修饰,包括N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine,m1A)、N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5C)、N7-甲基鸟苷(N7-methylguanosine,m7G)、5-羟甲基胞嘧啶(Hydroxymethylcytosine,5hmC)和假尿苷(Pseudouridine,Ψ)等。其中,m6A修饰尤其突出,它是丰度最高且在进化上最保守的修饰之一。现有大量研究分析了其对mRNA代谢各个方面的影响,包括转录、翻译、降解、稳定性、剪接和定位。m6A免疫共沉淀测序(MeRIP-seq)技术的发展促进了对于m6A调控网络在转录后调控、细胞过程和生物学功能中的关键作用的全面探索。值得注意的是,m6A修饰的改变与RNA代谢紊乱相关,并影响多种人类疾病,包括癌症、肥胖症、糖尿病、神经系统疾病和不孕不育等。目前,大多数人类肿瘤类型中均发现了m6A修饰失调,其主要通过调节致癌基因或肿瘤抑制基因的m6A水平,影响靶向转录本的转录后修饰和表达调控。探究癌症发生发展中m6A修饰的分子机制具有重要的临床意义和价值,可为抗肿瘤疗法提供潜在途径。

 

RNA剪接是调控真核生物基因表达的关键过程,主要为从pre-mRNA中去除非编码区域(内含子),并将外显子有序连接加工形成成熟mRNA。组成型pre-mRNA剪接主要涉及内含子的移除和外显子的连接,以确保基因表达的稳定性。可变剪接能从单一基因产生多个转录本和蛋白质异构体,其增强了基因表达的复杂性和蛋白质功能的多样性,对正常生理机能维持具有重要作用,同时也与帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓性肌萎缩、家族性自主神经功能障碍、囊性纤维化、弗雷泽综合症等多种疾病或癌症的发生发展有关。在肿瘤细胞中,可变剪接在多种恶性表型的发展中起着至关重要的作用,肿瘤特异性可变剪接事件有望成为潜在的诊断或预后标志物,并为针对肿瘤的靶向治疗策略开辟新的方向。

 

最近,越来越多的证据揭示了m6A修饰机制在可变剪接中的调控作用。尤其是甲基化转移酶METTL3缺失已被证明可以显著影响数千个基因的剪接模式。在AS事件中,m6A peak在外显子和内含子中富集,经剪接后,含有m6A修饰的外显子倾向于保留在mRNA中。这些发现突显了m6A修饰在AS中的重要贡献。

 

本文详细综述了m6A修饰在AS中的潜在机制、功能及其在肿瘤发生中的意义,还进一步探讨了依赖于m6A修饰的AS在肿瘤治疗中的潜力。

 

m6A修饰的调节

 

RNA的m6A修饰由m6A甲基转移酶(writers)、去甲基化酶(erasers)和m6A结合蛋白(readers)可逆调节(图1)。Writers负责在目标RNA的腺苷N6位点添加甲基基团,而erasers则移除这一基团。Reader能够识别并解读m6A修饰,进而启动对目标RNA的各种功能性影响。m6A的添加是由甲基转移酶复合体(MTC)催化的,该复合体包含诸如METTL3、METTL14、METTL16、WTAP、VIRMA、ZC3H13、RBM15及其同源蛋白(RBM15B)等关键甲基转移酶。MTC负责将m6A修饰引入腺苷的N6位置,此过程涉及甲基转移酶从S-腺苷蛋氨酸(SAM)转移甲基基团。METTL3作为m6A MTC的催化核心,与位于核散斑的METTL14形成一个稳定的异二聚体,以促进m6A修饰的高效发生。尽管METTL14不具备催化结构域和酶活性,但它作为METTL3的协同伙伴,通过结构支撑辅助其与RNA底物的相互作用。WTAP可将METTL3/METTL14异二聚体定位到核散斑,从而增强催化活性。METTL16负责催化U6 snRNA、lncRNA及pre-mRNA中内含子的m6A甲基化。此外,还有一种称为VIRMA(或KIAA1429)的蛋白质通过连接METTL3 / METTL14 / WTAP复合物与RNA底物来促进m6A定位。RBM15与METTL3和WTAP也会相互作用,进而确定DRACH位点。另外ZC3H13也被证实能增强WTAP的核定位。ZCCHC4作为一种特定的m6A甲基转移酶,主要介导28S rRNA的m6A修饰。E3泛素连接酶HAKAI,作为MTC的一个保守组分,维持其它MTC组分的稳定性,确保适当的m6A修饰。

 

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图1 m6A修饰的调控(m6A RNA修饰受到甲基转移酶(writers)、去甲基化酶(erasers)和m6A结合蛋白(readers)的可逆调节。writers负责将甲基基团添加到特定RNA分子中腺苷的N6位置,而erasers则移除这些甲基基团。另一方面,readers是一类RNA结合蛋白(RBPs),能够识别并解读m6A修饰,从而影响RNA的各种代谢过程,包括mRNA的翻译、降解、稳定性、剪接及定位)

 

RNA的m6A修饰的可逆过程由两种蛋白质FTO和ALKBH5调控,它们因能从目标mRNA上移除甲基化基团而被称为m6A“erasers”。FTO属于依赖铁离子(II)和草酰乙酸的AlkB氧化酶超家族,是首个被表征的m6A去甲基化酶。它于2011年发现,由此引入了可逆m6A修饰的概念。FTO负责移除内部的甲基基团,尤其偏好去甲基化m6Am,这是RNA中较为罕见的一种修饰。2013年,ALKBH5被确认为第二种m6A去甲基化酶,它能直接将m6A转换为腺苷,并与FTO协作以维持m6A水平的稳定。

 

m6A修饰通过与m6A RNA结合蛋白(RBPs)的相互作用,显著影响mRNA的代谢过程,而这些蛋白统称为“readers”。Readers蛋白能特异性地识别并结合含有m6A修饰的转录本,从而决定了RNA的命运。主要的readers蛋白包括YT521-B同源(YTH)结构域家族蛋白(YTHDF1/2/3)、含YTH结构域蛋白(YTHDC1/2)、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BPs)、异质核糖核蛋白(hnRNPA2B1、hnRNPC和hnRNPG)、真核启动因子3(eIF3)、FMRP蛋白和Prrc2a。这些readers调控mRNA代谢的多个方面,包括翻译、降解、稳定性、核输出、microRNA加工以及pre-mRNA的剪接。

 

例如,YTHDF1通过与翻译起始因子eIF3的相互作用,促进翻译起始和延伸。它与另一种reader蛋白FMRP竞争结合m6A修饰的转录本,从而抑制翻译。此外,IGF2BPs和YTHDC2增强其目标转录本的翻译。mRNA的降解和稳定性主要由reader蛋白调控,其中YTHDF2起主要作用,它与CCR4-NOT脱腺苷酸酶复合体共同促进mRNA的降解。而YTHDF3则与YTHDF1和YTHDF2协同调控含有m6A修饰的RNA的翻译或降解。YTHDC2和IGF2BPs也是多功能的readers蛋白,同样影响mRNA的降解和稳定性。而YTHDC1的抑制可以加速特定核mRNA的降解,还可以通过lncRNA XIST介导转录抑制,并与输出蛋白SRSF3和NXF1协同促进m6A修饰mRNA的核输出。另外,新型reader蛋白Prrc2a稳定靶向转录本。与其他reader蛋白相似,FMRP也影响甲基化mRNA的降解和核输出。除了对成熟mRNA的影响,m6A reader蛋白还调节lncRNA的生成和功能。hnRNPA2B1通过招募DGCR8蛋白促进初级miRNA向Pre-miRNA的加工。最近,YTHDF3被报道能增强环状RNA的生成并控制circ-ZNF609的翻译。YTHDC1也能识别m6A修饰的RNA,诱导转录凝聚体的形成和基因激活。此外,m6A readers参与AS,YTHDC1通过招募剪接因子SRSF3或以m6A依赖的方式限制SRSF10的招募,在293T细胞中促进外显子排斥事件发生。类似地,在MIN6细胞中,YTHDC1通过与SRSF3和CPSF6的相互作用调控AS。已被鉴定为m6A reader的NKAP可通过招募剪接因子SFPQ来调节m6A修饰转录本的转录终止位点的AS。NKAP还参与miRNA的成熟过程。hnRNPC和hnRNPG与目标RNA的结合是通过一种称为“m6A开关”的机制调控的,该机制同样涉及与m6A相关的AS。值得注意的是,hnRNPG与YTHDC1可协同促进Itbp3bp和Nek1的外显子排斥发生。

 

可变剪接

 

人类基因组测序计划已鉴定出约20,000个蛋白质编码基因,这一数字显著低于人类蛋白质的总数。AS作为一种关键的转录后过程,主要涉及外显子的重组,对于从单个多外显子基因产生多种蛋白质变体起着至关重要的作用。这种复杂的过程对哺乳动物的转录组和蛋白组多样性做出了重大贡献。在高度复杂的物种中,可变剪接事件频繁发生。据估计,人类中超过95%的多外显子基因经历可变剪接,这包括外显子缩短、延长、排斥或内含子保留等多种过程。精确调控可变剪接需要一个复杂的调控元件网络,包括结合到特定pre-mRNA序列上的剪接增强子和沉默子,以增强或抑制剪接过程。此外,众多RNA结合蛋白(RBPs)和剪接因子作为关键调控因子,可以决定剪接位点的选择并影响外显子的排斥或去除。这种精细的调控确保了特定细胞或组织中特定异构体的产生,从而产生具有不同功能的各种蛋白亚型。

 

(1) pre-mRNA的剪接机制

典型的剪接调控可以分为四个阶段:剪接体组装、催化激活、催化反应和剪接体分解。剪接体组装是一个多步骤且不可或缺的过程,对于剪接反应至关重要,其特征是一个由小核糖核蛋白颗粒(snRNPs,包括U1、U2、U4/U6和U5)以及超过150种组成性和辅助性蛋白质组成的大型分子复合体。在剪接体组装过程中,U1 snRNP最初通过位于5′剪接位点的共有motif CAGGURAGU与目标pre-mRNA相互作用。随后,U2AF65亚基结合到多嘧啶序列上,而U2AF35亚基则与3′剪接位点的AG二核苷酸结合,形成被称为U2 snRNP辅助因子的异二聚体。U2 snRNP被招募到pre-mRNA的分支点,接着U5和U4/U6三联snRNP加入到U1 snRNP中。多种DEAH-box RNA解旋酶随后改变snRNP之间的构象和组成,形成活性剪接体。snRNPs和其它剪接因子一起,与pre-mRNA结合共同构成剪接体,剪接体随后经历连续两次的酯交换反应,使得pre-mRNA内含子去除和外显子连接。在第一次酯交换反应中,外显子的3 '端形成一个分支结构;第二次酯交换反应释放该分支,去除内含子并连接外显子,最终生成成熟的mRNA(图2)。

 

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图2 pre-mRNA剪接示意图。剪接体的组装是剪接反应的一个关键而复杂的过程。剪接体复合体由小核核糖-核蛋白颗粒(U1-5 snRNPs)、前体mRNA和各种组成蛋白和辅助蛋白组成。经过两个连续的酯交换反应,协调内含子的去除和外显子的连接,产生成熟的mRNA

 

(2) 前体mRNA的AS机制

AS涵盖多种事件类型,包括(Cassette)外显子跳跃(SE)、互斥外显子(MXE)、可变5‘位点(A5' SS)、可变3’位点(A3' SS)、内含子保留(IR)、可变首外显子、可变末外显子、可变启动子和可变多聚腺苷酸化(图3)。这些事件类型由识别顺式作用剪接调控元件(SREs)的反式作用因子调控。SREs,包括外显子剪接增强子(ESE)、内含子剪接增强子(ISE),以及外显子剪接抑制子和内含子剪接抑制子,可以根据与反式作用因子的相互作用,促进或抑制RNA剪接。

 

控制可变剪接的反式作用因子主要由剪接因子组成,这些剪接因子即为RNA结合蛋白(RBPs),包括富含精氨酸/丝氨酸(SR)的蛋白质、异质核糖核蛋白(hnRNP)等。其中,SR蛋白剪接因子(SRSF1-12)因其在可变剪接中的关键作用,受到了广泛关注。通常,SRSFs具有一个或两个决定RNA结合特异性的RRM结构域,以及促进与其它SR蛋白相互作用的RS结构域。

 

SR蛋白在剪接体的组装和剪接体的重排中起着关键作用,它们对剪接的影响取决于它们在pre-mRNA中的结合位点。此外,SR蛋白不仅刺激外显子排斥,而且通过与pre-mRNA的相互作用诱导外显子跳跃。最初,SR蛋白被认为与ESEs或外显子区域结合以增强外显子的排斥,例如SRSF1在BclxL异构体的产生中调节外显子的排斥。然而,后续的研究揭示了SR蛋白也可以通过改变剪接位点的结合位点,从而诱导外显子跳跃。一般来说,位于外显子的SR蛋白作为剪接增强子,而位于内含子内的SR蛋白作为剪接抑制子。对于剪接体的组装,SRSF1、SRSF2和SRSF6通过将U1 snRNP招募到5 '剪接位点,将U2 snRNP招募到3 '剪接位点参与剪接体的形成。

 

相比之下,由23个成分组成的hnRNP蛋白通过改变其相对于被调节的剪接位点的结合位点来影响选择性剪接。与SR蛋白不同,hnRNPs最初被鉴定为主要结合内含子区域,这种相互作用通过破坏剪接体和剪接位点之间的联系来促进外显子跳跃,阻碍外显子识别。此外,SR蛋白和hnRNP蛋白表现出拮抗活性,可以促进或抑制剪接。

 

此外,许多组织特异性剪接因子均属于反式作用因子,如RBM5、RBM24、Nova1和QKI。这些剪接因子有助于产生具有独特时空特征的组织特异性AS事件,从而丰富细胞蛋白质功能的多样性。例如,RBM24与ISE相互作用并促进横纹肌中肌肉特异性外显子的保留。值得注意的是,某些非典型剪接因子如U2AF65、SF3B3和SF1通过直接结合pre-mRNA而不是SREs来调节选择性剪接。

 

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图3 组成型剪接和可变剪接模式的示意图。组成型剪接主要涉及内含子的去除和外显子的连接,以确保基因表达的稳定性。可变剪接事件主要包括以下几种不同模式:外显子跳跃、互斥外显子、可变5′剪接位点、可变3′剪接位点、内含子保留、可变首外显子、可变末外显子、可变启动子及可变多聚腺苷化

 

AS中m6A修饰的调控

 

作为最普遍的转录后修饰,m6A甲基化几乎影响mRNA加工的每一个方面,包括mRNA的翻译、降解、稳定性、可变剪接及定位。以往研究主要集中在m6A修饰在调控mRNA稳定性、降解和翻译中的作用,而目前已明确m6A还可以通过m6A结合蛋白招募剪接因子来调控pre-mRNA的AS(图1)。2021年,Wei G等人证明,大约10%的m6A信号位于小鼠胚胎干细胞的内含子/外显子内,这表明m6A机制与RNA剪接之间存在潜在的串扰。此外,内含子区域的m6A修饰调节AS事件,表明m6A修饰在剪接动力学和选择性剪接结果方面可以决定新生转录本命运。最近,Achour C等人提供了有力的证据表明m6A修饰在控制可变剪接转换中的作用。他们发现m6A修饰信号在目标转录本的剪接连接处富集,并通过转录调控因子MYC驱动剪接因子的表达,从而促使乳腺癌细胞获得恶性表型。与此同时,Jara-Espejo M等人首先发现了m6A与RNA G-四链体结构在内含子剪接位点共定位的现象。剪接因子具有识别靠近5′和3′剪接位点的内含子中保守m6A motif的能力,这意味着表观转录层面的m6A修饰可能与RNA G-四链体协同调控可变剪接过程。这些发现表明m6A修饰在调节可变剪接中起着重要作用。

 

(1) m6A writer的可变剪接机制

最近,越来越多的证据将m6A修饰与可变剪接联系起来。目前关于m6A writer调控可变剪接的研究主要围绕甲基转移酶METTL3展开。METTL3作为负责m6A甲基化的核心转移酶,会在特定的目标RNA上添加m6A修饰,进而影响多种肿瘤细胞的可变剪接过程。

 

Dominissini D等人的一项研究报导称,HepG2细胞中METTL3的下调会导致不同剪接形式的外显子和内含子出现,并且通过m6A-seq检测到m6A peak的累积,沉默METTL3可通过调控诸如MDM4、MDM2、FASBAX等经差异剪接产生的变体来调节p53信号通路,从而诱导细胞凋亡。这些发现强调了m6A在肝细胞癌AS事件中的重要作用。同样,METTL3的缺失会通过胶质瘤干细胞样MGG8细胞的异常选择性剪接破坏多种途径,包括p53信号传导、VEGF信号传导和细胞周期调节。在缺乏METTL3的胶质瘤干细胞中,表达下调的基因主要参与RNA加工和mRNA剪接。m6A修饰通过YTHDC1依赖性的无义介导的mRNA降解机制,增加了SRSF(特别是SRSF3、SRSF6SRSF11)的表达,这促进了抗凋亡BCL-X剪接变体和促进胶质瘤干细胞的NCOR2剪接变体的产生,最终促进了胶质母细胞瘤的生长和进展。在骨髓间充质干细胞中,METTL3的缺失不仅抑制了VEGFA的表达,还抑制了其剪接变体VEGFA-164VEGFA-188的表达。FUBP1已被CRISPR/Cas9筛选鉴定为一种具有“长尾”效应的癌症驱动基因。FUBP1与PTEN协同作用,能够扭转乳腺上皮细胞的恶性转化过程。阻断FUBP1能够通过阻止PTEN诱导的METTL3招募,从而减少整体的m6A水平。这一变化导致了AS的改变以及乳腺癌中异常驱动异构体的表达。这些发现表明METTL3是乳腺癌进展中AS事件的关键调控因子。m6A修饰的剪接转换在口腔鳞状细胞癌中也被发现。此外,m6A修饰不仅直接影响AS机制,还在多种癌症(包括慢性淋巴细胞白血病、白血病、乳腺浸润性导管癌、结肠腺癌、肺癌和胃腺癌)中以m6A依赖性方式调节各种剪接因子的表达丰度,间接影响AS。这些发现为m6A修饰在AS模式中扮演重要角色提供了有力证据。

 

靶向METTL3可以有效地在多种原发性癌症中产生差异剪接变体。具体来说,通过siRNAs沉默METTL3或使用METTL3药物抑制剂STM2457治疗,能显著改变前列腺癌细胞中雄激素调控的转录和剪接模式。METTL3的抑制导致众多差异AS事件的发生,特别是外显子跳跃。这伴随着雄激素受体全长转录本(AR-FL)与截短转录本之间占比的增加,为干预前列腺癌患者中雄激素信号传导提供了一个很有潜力的治疗靶点。METTL3而非FTO调控宫颈癌细胞中HPV16 E6/E7 mRNA的可变剪接和基因表达,推测m6A修饰在HPV诱导的宫颈癌发生中的潜在作用。另外,METTL3的敲低导致了1803个基因发生AS,这一现象在骨肉瘤细胞中伴随着与细胞周期相关功能的显著富集,其中69.2%-86.7%的基因在剪接位点附近存在m6A修饰。这些结果证明了m6A修饰介导的AS事件与癌症的起始和进展的相关性。

 

METTL3依赖的AS不仅出现在肿瘤细胞中,也存在于非肿瘤细胞中。METTL3的失活和随后的m6A修饰逆转导致的以外显子跳跃为主的异常剪接事件在突触相关途径中富集。METTL3缺失导致的Grin1外显子21跳跃,显著增加神经元细胞内钙离子水平,进而诱导细胞凋亡。METTL3缺失还被证明可通过m6A修饰调精子发生基因的AS,阻碍精原细胞的分化和生殖细胞减数分裂的启动。此外,METTL3的敲低可以调控MyD88的AS,导致MyD88 S异构体表达增加,抑制牙髓细胞中由脂多糖诱导的炎症反应。由此可见,m6A依赖性的AS模式对于肿瘤病理生理效应、患者预后以及广泛的细胞生理过程的调控至关重要。

 

果蝇已经成为研究m6A依赖性AS分子机制的强大体内模型。2016年,Lence T等人证明了m6A在通过AS调控性别决定中的重要作用。他们观察到,Ime4(果蝇中的METTL3同源物)或dMettl14的下调导致可变5'剪接位点和内含子保留,最终决定果蝇的性别。m6A修饰定位与雄性特异性外显子3的包含及雌性特异异构体减少相关联;而雌性特异的异构体则依赖于Sxl基因m6A依赖性的外显子3跳跃机制。五年后,更多证据表明,在雌性中,Sxl招募m6A writer组分,随后在Sxl转录本的外显子3及其相邻内含子中引入m6A修饰。接着,YTHDC1与m6A修饰区域相互作用,通过与剪接因子结合诱导外显子3的跳跃。这些研究共同支持了m6A依赖性Sxl可变剪接在果蝇性别决定中的功能重要性。然而,这一机制是否在哺乳动物中保守尚待确定。

 

除METTL3外,其他甲基转移酶也在可变剪接的调控中发挥作用。METTL14敲除突变体调控了少突胶质细胞前体细胞中Ptprz等基因的转录本及众多RNA转录本的AS事件,影响了364个基因中的1372个剪接事件,从而抑制少突胶质细胞的成熟,损害了髓鞘层的厚度,并伴随着髓鞘化轴突数量的减少。MAT2A被确认编码S-腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶。2021年的一项研究表明,秀丽隐杆线虫中的METT-10(人类METTL16的同源物)通过调控SAMS-3和SAMS-4的可变剪接来调节SAM合成酶的稳态,这一过程伴随着m6A修饰诱导的无义介导的mRNA降解。最近,METT-10和人METTL16如何在参与调控SAM稳态的SAMS基因的3'剪接位点诱导m6A修饰的机制也得以大量研究。研究揭示,尽管METT-10和METTL16通过不同可变剪接介导的调控机制调节SAM稳态,但在经历m6A甲基化的靶向RNA上,秀丽隐杆线虫与人类之间有着良好的保守性。

 

WTAP参与调节pre-mRNA(如Sxl、transformer和Ultrabithorax)的AS。果蝇中WTAP的同源蛋白hFL(2)D的缺失已被证明影响transformer pre-mRNA的3'可变剪切位点,这些位点是Sxl调节的底物。由此表明hFL(2)D在性别决定中起调控作用。此外,FL(2)d促进外显子3的跳跃以保持雌性特征,并且促进Ultrabithorax中小的内部外显子的包含。FL(2)d还与早期起作用的通用剪接调节因子如U2AF38、U170K、U2AF50和Snf相互作用,且以依赖Sxl的方式调控可变剪接。WTAP在哺乳动物细胞剪接事件中的作用已被研究过,IGF-1通过核26S蛋白酶体途径诱导WTAP蛋白降解,导致人血管平滑肌细胞存活因子survivin的剪接模式改变,具体来说,抗凋亡的survivin异构体增多,而促凋亡的survivin-2B异构体减少。这些发现强调了WTAP的核积累与survivin异构体平衡之间的明确联系。尽管WTAP与剪接模式转换有关联,但其效应是否依赖于WTAP介导的甲基转移酶活性仍有待确认。

 

作为split-ends蛋白家族的一员,RBM15参与了包括可变剪接等多种RNA代谢过程。RBM15与特定pre-mRNA的内含子区域(如GATA1、RUNX1、TAL1和c-MPL)相互作用,直接调控它们的AS。这种调控是通过招募内含子结合的剪接因子SF3B1来实现的。通过这一机制,RBM15有助于人原代细胞中巨核细胞的分化和成熟。然而,目前尚不清楚RBM15是否以依赖m6A的方式调控可变剪接。

 

(2) m6A eraser的可变剪接机制

证据显示,m6A去甲基化酶在调节可变剪接中发挥一定作用,特别是在响应多种细胞条件和病毒感染时,尤其是病毒感染凸显了m6A修饰与可变剪接之间的联系。通过MeRIP-seq技术,研究人员观察到Huh7细胞感染黄病毒后,CIRBP mRNA最后一个外显子的m6A peak减少。这种由感染引起的CIRBP转录本m6A修饰的减少调节了其可变剪接,导致内含子保留的长CIRBP转录本表达下调,而短的转录本不受影响。

 

已有研究发现去甲基化酶ALKBH5能促进含有内含子保留的HPV16 E6 mRNA的生成,并参与到C33A2细胞中晚期L1 mRNA的外显子跳跃中。ALKBH5通过去除m6A修饰,在精母细胞和圆形精子细胞中正确剪接较长的转录本。然而,若在生殖细胞中敲除ALKBH5,则会导致更长转录本中的剪接事件增加,进而影响雄性生育能力和精子发生。

 

有趣的是,ALKBH5依赖的可变剪接机制也已被阐明。通过使用rMATS工具,在过表达ALKBH5的PaCa-2细胞中总共鉴定了90个差异性的可变剪接事件(包括A5SS、A3SS、MXE、RI和SE)。结合RNA-seq和MeRIP-seq数据,研究人员得以筛选出低甲基化和剪接事件改变的基因,最终确定SLC25A37是唯一一个在m6A peak和剪接事件中均展现出显著变化的基因,涉及到两个包含A5SS和A3SS事件的低甲基化m6A区域。这些发现进一步说明,ALKBH5可以通过m6A依赖机制调节SLC25A37的RNA剪接,影响胰腺导管腺癌中的铁代谢。此外,ALKBH5介导的m6A去甲基化还减少了CELF2(一个参与剪接、翻译和编辑的剪接因子)的mRNA稳定性,间接影响胰腺癌中的剪接事件。CELF2控制CD44的可变剪接,通过外显子跳跃产生不同CD44转录本,其中CELF2促进CD44s向CD44v的转换,后者作为内质网相关降解信号通路的调节器,抑制胰腺癌发展。尽管如此,关于ALKBH5与人类肿瘤发生中可变剪接机制的联系的认识仍然有限。

 

另一个m6A去甲基化酶FTO也在可变剪接事件中发挥作用。研究表明,FTO介导的m6A去除阻碍了SRSF2的招募,导致Runx1t1中外显子6的跳跃,进而促进小鼠前脂肪细胞的分化。同样,Zhao X等研究也证实FTO的缺失增强了SRSF2蛋白识别外显子剪接增强子的能力,促进小鼠前脂肪细胞中Runx1t1的外显子6跳跃。这些发现共同强调了FTO依赖的可变剪接机制在m6A去甲基化依赖途径中的重要性,是脂肪生成过程中的关键调控机制。在人293T细胞中,FTO被观察到更倾向于与pre-RNA的内含子区域以及附近的可变剪接外显子和poly(A)位点相互作用。FTO缺陷导致广泛的剪接事件变化,特别是外显子跳跃的增加。而这种外显子跳跃模式在293T细胞中敲低METTL3(另一种参与RNA剪接的蛋白)后被逆转。与m6A甲基转移酶相似,去甲基化酶FTO通过调节并招募特定的剪接因子靶向目标mRNA来调控可变剪接事件。

 

(3) m6A识别蛋白(m6A reader)在AS中的作用

越来越多的证据支持m6A reader在可变剪接调控中的关键作用,它们常与SRSF蛋白协同工作。在这些readers中,YTHDC1在剪接调控方面研究最深入。现已被广泛认可的是,YTHDC1以m6A依赖的方式招募特定的剪接因子至m6A修饰位点,从而影响可变剪接事件(图4)。例如,在293T细胞中YTHDC1通过招募SRSF3促进m6A修饰mRNA中的外显子包含,同时拮抗SRSF10与mRNA的结合作用。RNA pull down实验表明,YTHDC1可以与SRSF10和SRSF3竞争性结合。m6A修饰对于促进SRSF3的核散斑定位、mRNA结合及参与可变剪接过程是必不可少的;而当SRSF10参与时,该修饰则抑制这些功能。当m6A甲基化被逆转或YTHDC1功能受损时,SRSF10则促进目标mRNA的外显子跳跃。最近的研究还表明,YTHDC1通过m6A依赖机制调节lncRNA HOXB-AS3的可变剪接,导致促白血病干细胞自我更新增加,加速急性髓系白血病恶化。

 

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图4 YTHDC1调控选择性剪接的机制。YTHDC1选择性地招募SRSF3而不是SRSF10,以促进m6A修饰的mRNA中特异性外显子的包含。然而,当m6A修饰消失时,这种偏好被破坏。此外,转运到细胞核中的AURKA将hnRNPK招募到YTHDC1,导致外显子跳跃事件

 

YTHDC1在人类肺癌细胞中通过AURKA介导的hnRNPK招募促进外显子3跳跃,产生促肿瘤的RBM4-Sexon3-变异体。此外,YTHDC1在HIV-1感染期间调控HIV-1 RNA的可变剪接也具有重要意义,并且在小鼠卵细胞发育和胚胎发育中起着关键作用,其失活导致显著的可变剪接事件,如Phf1内含子的保留。Hu Y等人研究了YTHDC1调控小鼠卵母细胞发育的潜在机制,他们观察到KIAA1429基因敲除下调了m6A水平,主要影响了参与卵子发生的mRNA的选择性剪接,KIAA1429通过YTHDC1招募SRSF3促进这种选择性剪接,导致外显子排斥事件发生。

 

IGF2BPs作为另一类m6A readers,也被证明通过影响可变剪接促进肿瘤进展。例如,IGF2BP3的缺失导致CD69、Hoxa7和Hoxa9等基因全长转录本和可变剪接短转录本表达下降,提示IGF2BP3是MLL-Af4驱动的白血病的关键调控因子及潜在治疗靶点。在肝细胞癌和肺癌中,IGF2BP3调控大量可变剪接事件,影响多个肿瘤途径,包括调节已知在多种癌症中异常剪接的PKM基因的可变剪接模式,可能促进肺癌发生,并为肺癌患者提供新的治疗靶点。此外,IGF2BP1介导的可变剪接也在肺癌的进展中发挥作用,IGF2BP1与其它剪接因子协同作用,通过可变剪接机制促进ncIMPAD1-203转录本的表达,促进肺腺癌上皮-间质转化过程和EGFR-TKI耐药,这些结果共同说明了IGF2BPs在调节各种癌症的选择性剪接模式中的关键作用。

 

此外,hnRNPC和hnRNPG等m6A readers通过结合m6A修饰的mRNA并调节其二级结构稳定性,影响蛋白质与RNA的相互作用,从而调控可变剪接(图5)。

 

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图5 hnRNPC和hnRNPG调控选择性剪接的机制。(A) m6A修饰调节了RNA二级结构的稳定性,促进了reader hnRNPC蛋白的结合。m6A修饰发生在lncRNA的发夹干上,改变了结构的稳定性,并促进了hnRNPC和UUUUU motif之间的相互作用,从而导致了靶RNA的选择性剪接。(B) hnRNPG的RRM和Arg-Gly-Gl (RGG) motif与m6A修饰的RNA结合。此外,它与RNAP聚合酶II (RNAPII)的磷酸化C端结构域相互作用,以促进其在外显子-内含子连接处的驻留。这种驻留增加了剪接位点的利用,最终诱导外显子包含。相反,hnRNPG的RGG motif突变诱导相反的效果

 

hnRNPA2B1是另一种m6A reader及剪接因子,它直接识别m6A "RGAC" motif以调节可变剪接。在MDA-MB-231细胞中,hnRNPA2B1的缺失对可变剪接的影响与METTL3的缺失相似,推测hnRNPA2B1充当m6A依赖性可变剪接的执行者。在过表达hnRNPA2B1的结肠癌细胞中,hnRNPA2B1显著影响可变剪接事件,表明其在结肠癌进展中起关键作用。在胃癌细胞中,hnRNPA2B1结合于BIRC5 pre-mRNA的第4外显子,这种结合导致促癌的BIRC5-202转录本增多,而抗癌的BIRC5-203转录本减少,促进了胃癌的发展及化疗抵抗。由Linc01232稳定化的hnRNPA2B1通过可变剪接增强了全长A-Raf转录本的表达,同时减少了短A-Raf转录本表达,这一过程激活MAPK信号通路促进了胰腺癌的转移。此外,hnRNPA2B1促进MST1R pre-mRNA的第11外显子跳跃,增加了头颈部癌症中的RONΔ165转录本,该转录本激活Akt/PKB信号,最终导致头颈癌中的上皮-间质转化。值得注意的是,作为m6A识别蛋白,hnRNPA2B1本身是一个负责调节剪接事件的剪接因子。因此需要进一步的研究来确定hnRNPA2B1依赖的可变剪接事件是否与m6A修饰有关联。

 

最近的研究揭示NKAP作为一种m6A reader,直接与SLC7A11 mRNA上的“RGm6AC”位点相互作用,通过招募剪接因子SFPQ促进其转录终止位点的剪接和最后一个外显子的保留,保护胶质母细胞瘤细胞免受铁死亡。这一发现预示着未来可能会鉴定出更多具有剪接功能的m6A 识别蛋白,同时也需要进一步探索其它已知m6A 识别蛋白是否也具有类似的剪接功能。

 

(4) AS调控 m6A 修饰

值得注意的是,AS事件有能力影响m6A修饰及其调控因子。METTL3的敲除并不能完全逆转mRNA的m6A甲基化,因为在多种细胞环境(包括小鼠胚胎干细胞、U2OS细胞和MEFs)中存在剪接后的METTL3变体。这些METTL3剪接变体能够有效绕过CRISPR/Cas9诱导的METTL3突变,编码具有催化活性的METTL3。Xu RY等人还在肝细胞癌中揭示了剪接后METTL3变体的存在,这些METTL3的剪接变体能在多种人体组织中被检测到。其中METTL3-D的变体经历了可变的3'端剪接事件,导致第4外显子缩短和内含子8和9的保留,最终减少了细胞内的m6A修饰水平。相比之下,全长METTL3-A转录本与肝细胞癌的进程正相关,促进细胞增殖、迁移和侵袭的增加。而METTL3-D转录本似乎通过降低m6A修饰水平来抑制肝细胞癌中的细胞增殖和转移。此外,在一些人体组织中已经鉴定出含有内含子8和9的METTL3转录本,在METTL3中保留内含子的剪接模式抑制转录输出,使得内含子保留在细胞质中,导致METTL3表达减少。

 

类似地,Chen S等人观察到CLK1介导的SRSF5在丝氨酸第250个位点的磷酸化增强了SRSF5在METTL14 pre-mRNA中的富集。这一磷酸化事件随后抑制了METTL14中外显子10的跳跃,导致在胰腺癌中METTL14-Lexon10+变体上调和METTL14-Lexon10-变体下调。而METTL14中外显子10的保留导致总m6A含量升高,加速了胰腺癌的转移。

 

此外,在YTHDC1基因的外显子11和内含子11跨越区存在m6A peak,紧邻5'剪接位点。METTL3的突然缺失已被证明可以增加小鼠胚胎干细胞中YTHDC1转录物的表达水平,并扰乱YTHDC1的AS。这些发现共同表明,可变剪接在m6A修饰机制的自我调控中发挥着重要作用。因此,m6A修饰与可变剪接之间这种复杂的相互作用,不仅表明它们之间存在相互影响,而且还为表观转录组修饰调控机制提供了新的见解。

 

m6A 甲基化在AS调控中的临床意义

 

m6A修饰在调节AS中的新兴作用正日益受到关注,尤其是疾病与癌症领域。针对参与AS的m6A机制进行靶向干预,为癌症的诊断和治疗提供了有前景的途径。尤为重要的是,m6A依赖的可变剪接与癌症预后相关,为预后和治疗分层提供了有力证据。例如,在低级别胶质瘤中,多达3272个AS事件受到m6A调控因子的影响。此外,通过影响免疫微环境,m6A相关的可变剪接在胶质瘤进展中发挥作用,使其成为胶质瘤患者预后评估和个性化治疗策略的潜在生物标志物。在食道癌中,也观察到了个体患者中m6A模式与AS特征之间的负相关。同样,m6A依赖性AS及其调控因子在临床特征中的参与表明它们作为非小细胞肺癌患者预后生物标志物的潜力。这些发现强调了在m6A修饰背景下AS的临床意义,m6A修饰机制自身的可变剪接可能代表了一条介导肿瘤进展的新的探索途径。此外,m6A 相关的选择性剪接事件可能被证明是癌症患者的有效预后生物标志物,具有基于 m6A 调节诱导的选择性剪接事件构建预后风险特征的潜力。

 

此外,m6A依赖性AS与肿瘤的发生和发展有关。m6A修饰也通过AS事件介导肿瘤细胞的化疗耐药。例如,在胰腺癌细胞中,SRSF3通过包含外显子1上调lncRNA ANRIL-L转录本的表达,从而增强对吉西他滨化疗的耐药性。值得注意的是,ANRIL的m6A修饰对于SRSF3介导的外显子1包含是必不可少的。相反,m6A修饰机制的AS也有助于抗肿瘤作用。具有抗肿瘤活性的天然化合物黄芩苷水合物,被证明能有效抑制鼻咽癌的生长,其是通过激活m6A甲基化,增加Suv39H1 pre-mRNA中选择性剪接与组成型剪接的比例实现的,具体机制为黄芩苷水合物诱导METTL3和METTL4上调,进而促进Suv39H1转录本内剪接位点的m6A甲基化。另一研究表明,m6A修饰通过YTHDC1依赖的AS机制促进NCOR2α亚型的增加和NCOR2α亚型的减少,从而维持胶质瘤干细胞的干性并减少胶质母细胞瘤的细胞凋亡。

 

这些发现共同表明m6A依赖性AS在调节多种肿瘤表型中的关键作用,也意味着靶向m6A依赖性的AS在癌症治疗中具有重要的前景。

 

结论与展望

 

本文综合探讨了m6A甲基化在RNA代谢、尤其在AS中的重要作用及其对生物过程和疾病的影响。m6A作为一种关键的RNA修饰,通过影响mRNA的稳定性、降解、翻译及可变剪接等,广泛调控细胞功能及疾病发展,特别是在癌症中。它能够作为分子开关调节AS事件,与多种剪接因子互动,如SRSF3、SRSF6和SRSF11,其中m6A reader蛋白如YTHDC1不仅调控剪接还受m6A修饰自身影响,说明了修饰与剪接间的复杂反馈机制。

 

m6A与肿瘤关系密切,其在癌症中的异常调控影响剪接模式,导致肿瘤特异性的剪接谱,为癌症治疗提供了新的潜在靶标。然而,关于m6A如何精确调控AS,尤其是在剪接位点附近修饰的规律及其与剪接复合体的相互作用机制,仍存在许多未知。此外,m6A reader蛋白之间是否存在协同作用、以及它们如何平衡促进与抑制剪接的功能,亦是当前研究的热点和难点。

 

最后,尽管已有针对m6A调控因子的抑制剂被开发,但对于这些抑制剂在AS调控中的具体作用及其对其它m6A调控因子功能的研究尚不充分,凸显了该领域研究的复杂和未知。总之,m6A修饰与AS的相互作用是理解基因表达调控复杂性及开发新型疾病治疗方法的关键途径,但仍面临诸多挑战以及亟待解决的问题。

 

 

 


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