英文标题：Single-cell long-read sequencing-based mapping reveals specialized splicing patterns in developing and adult mouse and human brain

发表期刊：nature neuroscience（IF：25）

发表时间：2024.4.9

通讯作者：Weill Cornell医学院神经科学副教授Hagen Tilgner博士

RNA剪切在大脑发育和功能中具有重要作用，特别是在不同大脑区域、细胞类型、发育阶段以及跨物种（小鼠和人类）中的复杂调控。RNA剪切允许一个基因产生多种蛋白质编码的mRNA分子，这对于塑造细胞身份和功能至关重要。然而，在此研究之前，对于大脑中全基因组范围内的完整剪切图谱的理解尚不全面。

该研究旨在通过单细胞长读长测序技术来揭示大脑中细胞类型特异性的剪切模式，这些模式在大脑的发育过程中如何变化，以及它们在健康和疾病中的潜在影响。具体而言，研究聚焦于分析从出生到成年期小鼠以及人类大脑样本中，单个细胞水平上的全长RNA剪切异构体表达情况，探索其在时间和空间维度上的差异，以及与疾病相关变异的关联。

1. 单细胞RNA测序鉴定出细胞群体的异质性

本研究收集了小鼠出生后第14、21、28和56天的海马体和视觉皮层组织以及小鼠成年（P56）的纹状体、丘脑和小脑组织进行单细胞转录组测序。经过过滤、质量控制、短读长分析得到了204,725个细胞，平均每个样本包含约9300个细胞，并将这些细胞归类为神经元、胶质细胞、血管细胞和免疫细胞三大类。通过可视化分析特定发育时期海马区的神经形成和少突胶质细胞成熟过程，以及P56小鼠各脑区的细胞类型分布，结果显示了区域特有的神经元群落，而胶质、免疫和血管细胞的表达模式在各脑区间较为一致，除小脑外，各样本的细胞总数和亚型分布大体一致。

图1 小鼠大脑细胞亚型按年龄和区域分配的概览。

2. 相同细胞类型也具有独特的isoform调控机制

使用ONT和PacBio HiFi测序分别产生了2.5亿和3800万条长读长序列。这些序列用于将多外显子转录本精确分配到单细胞中，以研究不同发育阶段、脑区和细胞亚型中的剪切多样性。研究揭示了“中心三角形”异构体的特性，即在所有三个变量（发育、脑区、亚型）上的变异性一致，这在兴奋性神经元中尤为明显，提示了亚型特异性潜在的调控复杂性。进一步分析显示，神经元的异构体变异性普遍高于胶质细胞和前体细胞，暗示神经元中存在更复杂的调控机制。超过70%的基因在不同细胞类型或条件下展示出异构体使用的独立变化，而近一半的基因在三个比较维度上均表现出异构体变异性，强调了异构体表达在介导细胞和大脑区域特异性中的重要作用。总结而言，研究揭示了细胞类型、发育阶段、脑区间异构体表达的精细调控格局，强调了剪切多样性在塑造大脑复杂性中的关键作用。

图2 小鼠大脑中细胞类型和脑区特异的剪切体表达源自多种不同机制。

3. 可变外显子组描绘了人类保守的细胞类型和大脑区域特异性剪切模式

研究聚焦于理解剪切过程如何影响基因表达的细胞特异性和时空变化，特别关注单个外显子层面的分析，通过测量四种主要脑细胞类型（星形胶质细胞、少突胶质细胞、兴奋性神经元和抑制性神经元）中的外显子剪切百分比（PSI，Percent Spliced In, Ψ），发现剪切模式并非由统一的年龄或脑区决定，而是与特定细胞类型密切相关。

鉴定出4,557个高度可变外显子（hVExs， ΔΨ≥0.25），这些外显子的差异反映了细胞亚型、脑区和发育阶段的变化，进而影响如转录调控、组蛋白修饰和突触功能等生物过程。并定义了一组在细胞类型或发育阶段极端可变的外显子（EVExs， ΔΨ≥0.75），并将这些EVExs分为五组（E1-E5），每一组代表不同类型的剪切动态性。

本研究为六个成年人大脑海马区生成了单细胞长读长数据，比较了人与小鼠之间细胞类型特异性外显子剪切情况，揭示了小鼠和人类大脑中细胞类型特异性剪切的保守性，尤其在成年期。约24%-48%的EVExs序列在人与小鼠间保守，并与人类神经系统疾病相关，如精神分裂症和阿尔茨海默病。

图3 可变外显子与特定剪切程序及功能相关且在人类中保守。

4. 青春期的大脑区域特异性增强

研究探索了大脑发育过程中细胞类型与区域对外显子剪切体差异的影响，重点分析了海马体与视觉皮层的神经元。在视觉皮层中，兴奋性和抑制性神经元的剪切相关性随发育时间变化表现出相反趋势，其中兴奋性神经元在P21至P28间经历显著的剪切模式转变。海马体与视觉皮层间的比较显示，兴奋性神经元在特定发育阶段（P21和P28）的剪切模式相关性降低，提示大脑区域特异性剪切程序可能经历了一段时间的增强或差异化调整。

图4 神经元外显子在小鼠视觉皮层与海马区之间及发育时间进程中展现出特异性变化。

5. 剪切与表达定义的胶质细胞成熟度不一致

研究通过对星形胶质细胞和少突胶质细胞的外显子剪切水平分析，揭示了细胞类型之间在剪切模式上的差异。基于剪切和表达的聚类结果不同，基因表达分析显示少突胶质细胞系与星形胶质细胞分离，而剪切模式分析则揭示了少突胶质前体细胞与星形胶质细胞在剪切上的相似性，提示剪切层面分析能捕捉到基因表达分析未显现的细胞特性。

图5 剪切与表达定义的胶质细胞成熟度不一致。

6. 发育过程中外显子变异的波动模式

本研究通过分析发育过程中外显子变异性的时间调控，揭示了细胞类型和大脑区域在外显子剪切中的动态变化规律。研究关注了1,072个外显子，这些外显子在不同发育阶段表现为显著的变异性变化，并归纳为9种主要的变化模式（G1至G9）。表明P21至P28是外显子变异性发生显著变化的关键时期，与细胞类型间的差异性变化紧密相关。不同模式（G1至G9）所关联的基因在功能上大多不重叠，比如与突触囊泡形成相关的功能与G1模式相关，而肌动蛋白丝帽组装功能与G5模式相关，这些关联与神经元和胶质细胞的发育分化过程相吻合。

本研究结合单细胞长读长测序技术，系统分析了成年大脑的区域特性、细胞亚型差异及发育动态，揭示了RNA异构体在神经元与胶质细胞中的复杂调控。呈现了对小鼠和人类大脑中可变剪接体表达情况的全面单细胞研究，以及剪接体表达变异在解剖结构和发育过程中的动态变化，通过构建一个跨发育时期、解剖区域乃至不同物种的单细胞全长剪接体调控精细图谱，揭示了多维度剪切体变异程度，对于理解脑功能和疾病具有重要意义。

参考文献：

Joglekar A, et al. Single-cell long-read sequencing-based mapping reveals specialized splicing patterns in developing and adult mouse and human brain. nature neuroscience.2024. 

doi:10.1038/s41593-024-01616-4