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产品简介
常见问题
经典案例
结果展示
Isoform定量转录组测序即Isoform定量全长转录组测序，是指使用Nanopore，无需打断直接对cDNA进行测序，获得高质量的全长转录本序列。可准确识别可变剪接、基因融合、可选择性多聚腺苷酸化（APA）和等位基因，并对异构体进行准确定量。
产品优势
由于可变剪切（超过90%人类基因要通过可变剪切产生转录本,其中60%的剪切变体会编码出不同的蛋白质异构体）的存在，一个基因往往对应多个转录本（Isoform），二代转录组只能对基因进行定量（基于最长转录本进行GO、KEGG等分析），Isoform定量全长转录组可实现转录本定量，对基因的每一个Isoform进行功能注释。
图1
Isoform定量全长转录组和二代转录组建库和比对分析和定量示意图
注释：二代转录组只能对基因进行定量，不能实现转录本定量，功能分析（GO、KEGG等）是基于最长转录本进行分析；Isoform定量转录组可实现不同Isoform的定量，对所有转录本进行功能分析。
案例一 慢性淋巴细胞白血病SF3B1基因突变的全长转录组特征揭示保留内含子的下调（IF=11.878）
SF3B1的复发性体细胞突变与多种疾病有关，在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中起着驱动作用。SF3B1突变诱导异常的剪切模式，短读长的转录组对可变剪切进行了研究，不过并未对异构体层面进行分析，同时内含子保留定量非常困难。
差异内含子保留（
IR
）分析
Nanopore序列可以检测连续的多个可变剪切（包括IR），更容易识别和量化IR。突变株中的IR异构体相对野生型表达整体下调，同时可以检测到IR同步的外显子跳跃的Isoform。
差异内含子保留的剪接位点分析
使用Nanopore测序共鉴定143个全长异构体，其中53个在野生型和突变株中存在显著差异，FLAIR识别出多个剪切类型。SF3B1
K700E
较SF3B1
WT
，基因LINC01089、LINC01480、XBP1内含子保留的异构体表达降低。这些IR异构体与3’末端剪切耦合，这种耦合很难用短读长检测到。
编码和非编码内含子保留异构体分析通过全长cDNA测序，能够更好地检测（而不是预测）PTC转录本的比例，更容易识别编码和非编码异构体，作者的结果与已经报道的数据结果一致，同时发现5个新的异构体。同时检测到相对于野生型，突变株的非编码内含子保留异构体下调。
结论
基于Nanopore的全长cDNA测序可以检测转录本全长，通过算法优化，相对于短序列，可以更准确的检测3′末端剪切，内含子保留，分辨生产性异构体和非生产性异构体。
参考文献
Tang AD. et al. Full-length transcript characterization of SF3B1 mutation in chronic lymphocytic leukemia reveals downregulation of retained introns. Nature Communications 2020;11(3) :1-12.
案例
二
纳米孔测序揭示了全长原肌球蛋白1亚型及其在大鼠心脏发育过程中的RNA结合蛋白调控（BioRxiv预印本）
Tpm1是心肌中主要的肌球蛋白基因，其突变或异常表达与多种疾病相关。大鼠不同发育时期心脏细胞中具有不同外显子组合的全长
Tpm1
亚型，RNA结合蛋白RBFOX2通过末端外显子剪接控制肌肉特异性Tpm1亚型的AS和Tpm1蛋白的表达。
全长转录组测序检测大鼠心脏不同发育阶段Tpm1 isoform
RBFox2
基因对Tpm1
表达量的影响
在H9c2细胞中，敲除RBFox2，导致外显子9b表达的肌肉特异性Tpm1转录本表达减少，但不影响外显子9d表达的非肌肉Tpm1转录本。
PTBP
基因对Tpm1
表达量的影响
在H9c2细胞中，敲除PTBP基因，发现肌肉特异性Tpm1转录本增加，与RBFOX2敲除的情况相反，非肌肉Tpm1亚型没有显著变化，表明与RBFOX2一样，PTBP也调节肌肉特异性Tpm1亚型。在PTBP敲除细胞中，Tpm1外显子6a被抑制，与RBFOX2敲除观察到的相反。
重新表达
RBFox2
基因可恢复部分对Tpm1基因的调节功能
参考文献
Jun Cao. et al.（2020）Nanopore sequencing reveals full-length Tropomyosin 1 isoforms and their regulation by RNA binding proteins during rat heart development.bioRxiv 2020.07.30.229351; doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.30.229351
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编码和非编码内含子保留异构体分析通过全长cDNA测序，能够更好地检测（而不是预测）PTC转录本的比例，更容易识别编码和非编码异构体，作者的结果与已经报道的数据结果一致，同时发现5个新的异构体。同时检测到相对于野生型，突变株的非编码内含子保留异构体下调。
