超过90%人类基因通过可变剪切产生异构体（Isoform），平均每个基因产生3-6个Isoform（每种细胞类型表达最高的2个lsoform），其中60%的剪切变体会编码出不同的蛋白质异构体，二代转录组一般对基因进行定量（基于最长转录本进行GO、KEGG等分析），Isoform定量转录组可实现转录本的定量，对基因的每一个Isoform进行解析。

Isoform定量全长转录组和二代转录组建库和定量的比较示意图

注释：

二代转录组一般对基因进行定量，不能实现转录本准确定量，功能分析（GO、KEGG等）是基于最长转录本进行分析；Isoform定量转录组可实现不同Isoform的定量，对所有转录本进行功能分析。

案例一

Nanopore全长转录组揭示牦牛生长发育机制(International Journal of Biological Macromolecules, lF=7.7)

牦牛是青藏高原的重要家畜，为牧民提供肉、奶、毛皮等资源，但低繁殖效率(如季节性发情、低怀孕率)限制了其生产力。睾丸发育对提高繁殖效率至关重要，然而短读长RNA测序的局限性使牦牛睾丸发育的分子机制尚未完全阐明。

本研究以6月龄、18月龄、30月龄、4岁的公牦牛和4岁的杂交牛为研究对象，各年龄阶段选取3个个体的睾丸样本，进行ONT全长转录组测序。每个样本产生了9,100,484到13,084,496条clean reads，平均读长为937.7 bp。通过与参考基因组比对，鉴定到24,480个基因和40,038个新转录本，其中大部分为新转录本，且9,568个新转录本通过功能注释得到解析。随机选取10个新转录本进行PCR验证，结果显示PCR扩增产物的大小与目标一致，表明ONT测序结果准确。

研究鉴定出15,355个可变剪接事件，分为7种类型，包括外显子跳跃、3'和5’可变剪接等。不同年龄阶段的剪接事件分布差异显著，6月龄的可变剪接事件较少，可能与该阶段睾丸尚未进入减数分裂期有关。

通过不同发育阶段的比较，鉴定得到多个差异表达转录本(DETs)，通过不同发育阶段的比较，鉴定得到多个差异表达转录本(DETs)，表明睾丸组织中的转录本表达变化更为显著。

通过WGCNA方法构建的基因共表达网络分析，得到21个共表达模块。其中，蓝色模块与6月龄阶段相关性最高，深灰色模块与18月龄阶段紧密相关。KEGG通路富集分析显示，不同发育阶段与特定信号通路相关：6月龄阶段主要涉及细胞结构、激素合成和蛋白质合成通路；18月龄和30月龄阶段涉及代谢和Hippo信号通路；4岁阶段则与代谢和激素合成通路相关，这些通路的活跃可能为精子发生创造适宜的微环境。

本研究通过ONT全长转录组测序，揭示了牦牛睾丸发育的分子机制，为改善牦牛繁殖效率提供了重要理论依据。

参考文献：Wang X, et al. Complete characterization of the yak testicular development using accurate full-lenath transcriptome sequencing.International Journal of Biological Macromolecules, 2024

案例二

项目案例 Nanopore全长转录组揭示可变剪接调控植物光形态建成的分子机理（The Plant Cell，IF=12.085）
 

选择性剪接（AS）是一个关键的转录后过程，可调控基因转录翻译成不同的蛋白质变体，多用于蛋白质组多样性和基因调控研究。本研究发现拟南芥RNA解旋酶UAP56在体内外与光信号通路中的核心角色E3泛素连接酶COP1相互作用，并通过Nanopore全长转录组测序技术阐明UAP56和COP1共同调节许多基因的表达水平以及许多常见前信使RNA（mRNA）的剪接。

UAP56和COP1共同调节基因表达
为了研究UAP56和COP1如何共同调控光形态发生，对d3#2和cop1-4以及Col-0进行了Nanopore全长转录组测序分析。在黑暗和红光照射1小时后，与Col-0相比，在d3#2系中发现了也受COP1的调控基因。UAP56和COP1共同调节与光合作用及光应答相关的基因表达，以及黑暗或光明中的激素反应。

UAP56和COP1控制mRNA的选择性剪接
d3#2和cop1-4中的剪接模式在黑暗和光明中与Col-0相比有很大不同。414和503个AS事件分别在黑暗和红光照射中由UAP56与COP1共同控制。共调节AS事件的基因在uap56和cop1系中部分重叠。

UAP56和COP1调节光介导的AS
比较d3#2和cop1-4中受光-暗调节的AS事件，发现433和599 AS事件分别受到黑暗和光明中UAP56突变的特异性影响。d3#2和cop1-4背景中剪接效率的变化与Col-0有很大不同。

结论：
该研究一方面鉴定到光形态建成的新成员UAP56，另一方面发现了COP1作为可变剪接调节因子的新功能，揭示了UAP56与COP1共同通过调节下游基因可变剪接来调控光形态建成的分子机制和调控网络，增加了对植物光信号转导机制的认识。
 
参考文献：
Yang Li, et at. The RNA helicase UAP56 and the E3 ubiquitin ligase COP1 coordinately regulate alternative splicing to repress photomorphogenesis in Arabidopsis. The Plant Cell,2022