Isoform（亚型）是由同一基因通过不同剪接方式产生的转录本异构体，具有多样性和时空特异性表达特点，在蛋白质组多样性、生物功能调节及疾病发生中起重要作用。人类基因组中约95%的多外显子基因存在选择性剪接，由此产生的蛋白质亚型可参与信号传导、代谢调控等不同的生物通路^[1]。平均每个基因有超过7个isoforms^[2]，约15%的人类遗传性疾病和癌症与选择性剪接有关^[1]，但60-80%的isoforms无法被短读长RNA-seq检测到^[3-4]。然而，目前大部分基于短读长测序的单细胞水平研究无法关注到细胞中Isoform的多样性。

其次，截止2025年，Pubmed上检索“Single cell transcriptome”的文章已超1万篇，其中IF＞10的文章占比28%，但2024年这一比例降至10%左右。而检索“Long-read single cell RNA sequencing”文章仅50余篇，其中60%以上的文章IF>10。这表明单细胞全长测序不仅是方法学的迭代，更是打开“细胞异质性全景图谱”的钥匙——尤其在肿瘤微环境、神经科学、干细胞命运决定等研究领域，率先开展单细胞全长转录组测序的研究团队已抢占了先机。

传统二代单细胞转录组（如10x Genomics平台、华大C-TaiM4等）通常基于3’或5’端标签捕获mRNA，合成全长cDNA后通过酶切打断，仅对cDNA的3'端进行测序，后续用Read2插入片段的91bp与参考基因组比对。而单细胞全长转录组在获取全长cDNA以后无需打断，直接构建三代测序文库。用三代平台进行测序，直接读取全长序列，可以精准检测可变剪接、融合基因、lncRNA等关键信息。

二代单细胞转录组和单细胞全长转录组比较

单细胞全长转录组具体的实验流程如下：

1. 样本制备：对新鲜组织进行解离，制备单细胞悬液；

2. 油包水（GEMs）生成：通过10x Genomics平台（或其他平台）对单个细胞进行捕获标记；

3. 反转录与扩增：在油包水中反转录合成全长cDNA；

4. Nanopore建库测序：利用Oxford Nanopore测序平台，直接读取全长转录本序列。

单细胞全长转录组实验流程

单细胞全长转录组测序技术通过直接捕获全长转录本，为复杂生物学问题的研究提供了高分辨率解析工具，其核心应用场景包括以下方向：

1. 肿瘤研究：异质性解析和耐药性探索

单细胞全长转录组可识别肿瘤细胞亚群特异性异构体（如融合基因、可变剪接事件等），揭示肿瘤进化路径。例如，Nature Communications发表的卵巢癌研究鉴定到IGF2BP2::TESPA1融合基因，并发现间皮细胞向癌相关成纤维细胞的转化机制^[5]。

2. 探索神经科学：解析神经发育与疾病机制

长读长技术可追踪神经元发育过程中可变剪接事件（如自闭症相关基因的剪接异常），揭示神经精神疾病的分子基础。长链非编码RNA在哺乳动物大脑的发育、成熟和疾病中发挥着重要作用，单细胞全长转录组可以检测长链非编码RNA（lncRNA）的全长结构，发现其在神经退行性疾病中的调控作用。

例如，2025年3月24日，发表在Neuron上的“Single-cell spatial transcriptomic atlas of the whole mouse brain”一文，团队首次整合了长链非编码RNA的单细胞级空间表达数据，发现长链非编码RNA的表达在成年小鼠大脑中具有区域选择性，在发育中的小鼠大脑内则呈现出时空动态性，为神经功能与非编码RNA相关性的研究奠定了基础^[6]。

小鼠大脑中lncRNA图谱^[6]

3. 发育生物学：解码细胞命运决定

在发育生物学研究中，单细胞全长转录组技术可用于构建胚胎细胞分化路径，解析胚胎发育过程中，心脏、肝脏等器官形成过程中基因表达的动态变化及可变剪接事件。鉴定干细胞分化各阶段的特异性异构体（如睾丸发育中生殖细胞特异性转录本^[7]），揭示干细胞命运决定的分子机制，对于理解生命发育过程、探索再生医学具有重要的理论和实践意义。

4. 细胞图谱构建：多器官Isoform图谱

构建单细胞分辨率的多器官Isoform图谱，在衰老、肿瘤、罕见病等领域展现出了独特价值。未来有望出现小鼠衰老或其他模式动物（果蝇、斑马鱼、食蟹猴等）的全器官单细胞Isoform图谱。

例如，bioRxiv上发布的“Mouse Single-Cell Long-Read Splicing Atlas by Ouro-Seq”一文中，对成年小鼠12个主要器官和组织的103,304个核或细胞的全长转录组分析，构建了小鼠单细胞长读长剪接图谱。该图谱全面描述了不同细胞类型的选择性剪接、选择性启动子使用和选择性多聚腺苷酸化事件，揭示了以前未被重视的功能异质基因^[8]。

小鼠单细胞长读长剪接图谱的概述^[8]

单细胞全长转录组不仅能进行基因聚类注释，还可基于转录本进行聚类，发现与Isoform相关的细胞亚型。具体差异如下：

1. 基于基因和转录本分别对细胞进行降维聚类

由于单细胞全长转录组对转录本全长进行测序，可以基于基因和转录本分别对细胞进行降维聚类。

基因UMAP和Isoform UMAP图^[9]

二代单细胞短读长测序对细胞进行聚类，可能会因为一些转录本未检测，从而遗漏掉一些细胞亚型。例如，小鼠视网膜单细胞全长转录组文章中，长读长数据识别出一个额外的BC类型BC4，这在短读长数据中被遗漏^[10]。

视网膜单细胞全长转录组鉴定双极细胞新的亚型-BC4^[10]

2. 异构体（Isoform）鉴定

来自一个基因的mRNA前体通过选择性剪接产⽣多种不同的mRNA序列（即异构体，Isoform），它们的编码区不一样，翻译的蛋白质功能不同。这对细胞的功能和特性有着重要影响。通过单细胞全长转录组测序技术，可以精确地鉴定这些异构体。

通过分析 Isoform 的分型以及不同细胞中各类转录本的数量，能够深入了解基因表达的复杂性和多样性。不同细胞中 Isoform 的转变频率也不尽相同，这进一步反映了细胞在功能和调控方面的差异。对 Isoform 的准确鉴定，有助于揭示细胞在不同生理和病理状态下的分子机制，为疾病的诊断、治疗以及药物研发提供关键的理论依据。

Isoform分型和不同细胞不同类型转录本数量^[11]

不同细胞中Isoform转变细胞频率图^[12]

3. 融合基因鉴定

通过单细胞全长转录组可以识别细胞中两个或多个基因的编码区首尾相连形成的嵌合基因，这些基因受同一套调控序列控制并可能编码异常融合蛋白。融合基因的产生通常与基因组或转录本层面的结构变异有关，例如染色体易位、倒位或RNA剪接异常等情况，鉴定融合基因对于研究肿瘤等疾病的诊断、治疗指导、预后评估具有重要意义。

肿瘤和患者特异性检测IGF2BP2::TESPA1基因融合^[5]

4. 非编码RNA（lncRNA）分析

单细胞全长转录组可以检测细胞中长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)的表达水平、细胞特异性表达模式。可识别特定细胞亚群中高表达的lncRNA，为肿瘤微环境研究、细胞分型及疾病标志物发现提供新靶点。例如，前列腺癌尿液lncRNA PCA3已作为临床诊断标志物。

小鼠大脑14个脑区中区域富集的lncrna的热图^[6]