2. 敲低LINC02776抑制卵巢癌细胞增殖

LINC02776位于染色体1q25.1区域，主要有两个剪接变体，即isoform 1（长度为335个核苷酸，nt）和isoform 2（659 nt）。通过5′和3′ RACE实验进一步验证了这两个变体的存在。利用定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析发现，LINC02776-isoform 1在顺铂耐药细胞系中表达显著升高（p < 0.0001，p = 0.002）。相反，LINC02776-isoform 2在顺铂耐药细胞系中表达显著下调（p = 0.0063，p = 0.0003），但在铂类耐药组织中并无显著表达差异（p = 0.4332）。

为了评估LINC02776的蛋白编码潜力，我们采用了三个计算工具：编码潜能评估工具（CPAT）、CPC2在线工具（http://cpc.gao-lab.org）以及PhyloCSF密码子替代频率分析，结果均表明，LINC02776不具有蛋白编码能力。此外，体外转录/翻译实验也证实LINC02776可以被转录但无法被翻译。这些结果表明LINC02776-isoform 1（335 nt）是卵巢癌细胞中主要表达的转录本，在顺铂耐药细胞中显著上调，且不具备蛋白编码功能。值得注意的是，敲低LINC02776并不影响其isoform 2或邻近基因RC3H1和RC3H1-IT1的表达。功能实验（包括克隆形成和CCK-8细胞增殖实验）表明，敲低LINC02776显著抑制了A2780和OVCAR3细胞的增殖能力（图2A、B）。相反，在内源性LINC02776表达水平较低的SKOV3和HEY细胞中过表达LINC02776，显著促进了两种细胞的增殖（图2C、D）。EdU实验结果显示，敲低LINC02776显著抑制DNA复制（图2E、F），而LINC02776的过表达则促进了DNA复制（图2G、H）。综上，这些结果表明LINC02776可促进卵巢癌细胞的增殖和DNA复制，而其敲低则会损害这些过程。这提示LINC02776可能在卵巢癌化疗耐药中发挥关键作用，并可能作为一个潜在的治疗靶点。

图2. LINC02776在体外促进卵巢癌（OC）细胞增殖

3. LINC02776通过减轻DNA损伤调控卵巢癌细胞对顺铂的敏感性

顺铂是一种基于铂的化疗药物，其抗肿瘤作用主要通过诱导DNA损伤和抑制DNA合成，最终引发肿瘤细胞凋亡。我们之前的研究结果已表明，LINC02776在铂类耐药的卵巢癌（OC）组织和细胞系中显著上调。为进一步验证LINC02776在顺铂耐药中的作用，我们进行了CCK-8、克隆形成和药物敏感性实验。结果显示，在OVCAR3和A2780细胞中敲低LINC02776可增强其对顺铂的敏感性（图3A），而在SKOV3和HEY细胞中过表达LINC02776则增强了其对顺铂的耐药性（图3B）。在顺铂处理条件下，敲低LINC02776显著抑制了OVCAR3和A2780细胞的增殖（图3C），而LINC02776的过表达则增强了细胞增殖能力（图3D）。此外，敲低LINC02776可诱导细胞周期在S期阻滞，并增加Annexin V+早期凋亡细胞比例；相反，过表达LINC02776则抑制了SKOV3和HEY细胞的凋亡。这些现象在顺铂耐药的卵巢癌细胞系（A2780-DDP和SKOV3-DDP）中也得到了验证。这些结果总体表明，敲低LINC02776可以增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

为了进一步探究LINC02776是否通过调控DNA损伤来影响顺铂耐药，我们在敲低LINC02776后，用顺铂处理OVCAR3和A2780细胞24小时。Western blot结果显示，LINC02776敲低显著增加了γ-H2A.X的表达水平，γ-H2A.X是DNA双链断裂（DSB）的标志分子（图3E）；相反，在SKOV3和HEY细胞中过表达LINC02776则降低了γ-H2A.X的表达（图3F）。免疫荧光染色进一步验证了上述结果：敲低LINC02776细胞中γ-H2A.X foci数量明显增加，而过表达组中则显著减少（图3G、H）。在顺铂耐药细胞中也观察到了类似的变化。此外，我们还检测了caspase 3/7的活性，这是一种凋亡过程中常被激活的蛋白酶。结果发现，在顺铂处理的细胞中，敲低LINC02776显著提高了caspase 3/7活性（图3I），而其过表达则显著抑制caspase 3/7的活性（图3J）。这些结果说明，敲低LINC02776可增强DNA损伤的积累并促进细胞凋亡，从而增强顺铂敏感性。

为进一步验证在体内敲低LINC02776是否也能增强顺铂敏感性，我们使用转染了sh-LINC02776慢病毒的A2780细胞建立了小鼠皮下移植瘤模型，并给予小鼠顺铂或5%葡萄糖溶液（GS）腹腔注射治疗。qRT-PCR分析显示，在shLINC02776-2 + GS组和shLINC02776-2 + 顺铂组中，LINC02776表达显著下降（p < 0.0001）。相比对照组，LINC02776敲低组的肿瘤体积和质量明显减小（图3K），提示靶向LINC02776可抑制肿瘤生长。此外，在LINC02776缺失的异种移植瘤中，顺铂处理显著增强了γ-H2A.X信号和细胞凋亡水平，同时降低了Ki67增殖标志物的表达（图3L）。这些发现表明，LINC02776敲低能够增强顺铂诱导的DNA损伤和细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长并提高顺铂敏感性。综上，我们的研究为LINC02776在调控卵巢癌细胞顺铂敏感性方面提供了有力证据，其机制可能与DNA损伤和凋亡信号通路调控密切相关。靶向LINC02776有望成为克服卵巢癌铂类耐药的一种潜在治疗策略。

图3. 敲低LINC02776在体内外均可增强卵巢癌（OC）细胞对顺铂的敏感性

4. LINC02776通过结合PARP1促进卵巢癌细胞中DNA损伤诱导的PARylation反应

为阐明LINC02776在卵巢癌（OC）细胞中促进顺铂耐药的机制，我们首先进行了生物素标记的RNA pull-down实验，随后结合质谱（MS）分析（图4A）。MS结果显示，LINC02776 RNA特异性结合的蛋白中包含PARP1，提示两者存在相互作用（图4B、C）。这一相互作用随后在A2780-DDP细胞中得到了进一步验证，同时使用长度相同但二级结构不同的反义链作为阴性对照。为了确定LINC02776与PARP1相互作用所依赖的关键结合区域，我们基于RNAfold预测的二级结构，将LINC02776分割成多个片段并进行了RNA pull-down实验（图4D）。实验结果表明，完整长度的LINC02776对于与PARP1的结合是必需的（图4D）。我们随后通过RIP实验进一步验证了两者的结合关系，使用PARP1抗体免疫共沉淀后检测LINC02776的富集程度，结果显示LINC02776在PARP1免疫复合物中显著富集（图4E）。进一步的RIP实验明确指出，LINC02776主要与PARP1蛋白的779–1014氨基酸区域结合（图4F–H）。免疫荧光共定位实验也显示LINC02776与PARP1在卵巢癌细胞中共定位。综上所述，这些结果表明LINC02776可在卵巢癌细胞中直接与PARP1结合。为研究这种相互作用的功能后果，我们检测了敲低或过表达LINC02776是否会影响PARP1的表达水平。结果发现，无论是LINC02776的敲低还是过表达，均不会影响PARP1的mRNA或蛋白表达。同样地，干预PARP1的表达也不会改变LINC02776的表达水平。

PARP1是一种关键的DNA修复蛋白，其通过催化多聚ADP核糖化（PARylation）实现修复功能，这一过程依赖于NAD+作为底物，生成的PAR聚合物可附着于受体蛋白（包括PARP1本身）上。鉴于LINC02776结合的是PARP1的催化结构域，我们进一步探究PARylation是否影响其相互作用。RNA pull-down和RIP实验结果显示，使用PARP1抑制剂Olaparib处理细胞后，LINC02776与PARP1的结合显著减弱，说明该相互作用依赖于PARylation活性。接下来我们推测，LINC02776可能调控PARP1介导的PARylation活性。在顺铂处理条件下，敲低LINC02776显著降低了OVCAR3和A2780细胞中PAR化蛋白的水平（图4I），而LINC02776过表达则明显提高了SKOV3和HEY细胞中的PARylation水平（图4J）。

此外，LINC02776过表达的细胞对Olaparib的抑制更不敏感，需要更高浓度才能抑制PARylation（图4K）。PARP1酶活检测进一步证实，LINC02776的过表达可增强PARP1的酶活性（图4L）。为了进一步分析PARylation的动态变化，我们用H₂O₂（一种经典的DNA损伤诱导剂）处理OVCAR3和A2780细胞。结果显示，H₂O₂诱导后PARylation蛋白迅速升高，但在LINC02776敲低的细胞中，该诱导效应显著减弱。值得注意的是，尽管对照细胞（siNC）在H₂O₂处理后快速诱导PARylation，但在30分钟内无论对照组还是敲低组PAR水平都恢复至基线（图4M、N），提示LINC02776并不影响PAR的去聚合过程，而是增强了PARylation的启动与维持。考虑到已有研究指出PARylation水平升高与顺铂耐药相关，我们通过Western blot在卵巢癌组织中进一步验证了上述发现（。重要的是，在LINC02776过表达的SKOV3和HEY细胞中，同时给予顺铂与Olaparib治疗可消除对照组与过表达组之间在顺铂敏感性方面的差异。综上所述，我们发现LINC02776可通过增强PARP1介导的PARylation反应来降低DNA损伤，从而促进卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。靶向LINC02776与PARP1的相互作用可能成为克服卵巢癌铂类耐药的潜在治疗策略。

图4. LINC02776与PARP1相互作用，促进卵巢癌（OC）细胞中DNA损伤诱导的多聚ADP核糖化（PARylation）

5. LINC02776通过恢复同源重组促进药物耐药性

LINC02776的表达可增强DNA损伤诱导的PARP1活化，提示在LINC02776高表达的卵巢癌（OC）细胞中，可能需要更高浓度的Olaparib才能有效抑制PARP1活性（图4）。此外，敲低LINC02776显著增加了与染色质结合的PARP1水平，提示LINC02776可能通过抑制PARP1在DNA损伤位点的捕获，从而缓解Olaparib诱导的“PARP1陷阱”效应。为了验证LINC02776的表达是否影响卵巢癌细胞对Olaparib的耐药性，我们进行了CCK-8、克隆形成和药物敏感性实验。结果显示，敲低LINC02776显著提高了卵巢癌细胞对Olaparib的敏感性（图5A、C），而过表达LINC02776则降低了细胞对Olaparib的敏感性（图5B、D）。PARP1是DNA双链断裂（DSB）修复的关键因子，参与多种修复通路，包括A-NHEJ、NHEJ和同源重组（HR）通路。

为明确LINC02776主要调控哪种DNA修复通路，我们采用携带GFP报告系统的U2OS细胞模型，对HR、NHEJ和A-NHEJ三种修复机制进行检测。结果表明，敲低LINC02776显著降低了HR修复的频率，而对NHEJ和A-NHEJ无明显影响（图5E）；相反，过表达LINC02776可显著提高HR修复效率（图5F）。鉴于PARP1在HR修复中发挥重要作用，尤其是在招募关键HR相关蛋白如BRCA1和RAD51方面的功能，我们进一步评估了LINC02776对这些蛋白染色质结合能力的影响。结果发现，在顺铂处理条件下，敲低LINC02776显著抑制了BRCA1和RAD51向染色质的募集（图5G–J）。这些发现表明，LINC02776可通过增强PARP1介导的PARylation活性并促进BRCA1和RAD51的染色质募集，从而提升HR修复效率，进而介导卵巢癌细胞对顺铂和Olaparib的耐药性。综上所述，这些结果揭示了LINC02776在调控HR修复效率中的关键作用，并提示其可能成为克服卵巢癌对铂类和PARP抑制剂耐药的潜在治疗靶点。

图5. LINC02776促进Olaparib耐药性及同源重组（HR）修复的恢复

6. HIF-1α在调控LINC02776转录中起关键作用

为探究LINC02776在铂类耐药卵巢癌（OC）细胞和组织中表达上调的机制，我们利用FANTOM5数据库的数据分析了其启动子区域（从转录起始位点向上游150 bp至下游950 bp）。随后，将该区域的全长及不同截短的启动子DNA片段克隆至荧光素酶报告载体中。荧光素酶活性检测结果显示，−30至+560 bp的区域具有显著高于其他截短片段的转录活性（p < 0.0001，图6A），因此该区域被鉴定为LINC02776的核心启动子区域（图6B）。该区域包含多个低氧反应元件（HREs）。为验证HREs在LINC02776转录调控中的功能，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验。结果显示，HIF-1α主要结合于LINC02776启动子区域中的第一个和第二个HRE位点（图6C）。进一步地，为验证低氧是否调控LINC02776的转录，我们用化学低氧诱导剂CoCl₂处理卵巢癌细胞。结果表明，LINC02776的表达呈现剂量依赖性和时间依赖性上调（图6D、E）。作为阳性对照，已知的低氧诱导lncRNA LncUCAT1也表现出表达上升的趋势。此外，我们还将OC细胞置于1% O₂的低氧条件下培养，结果同样观察到LINC02776表达随时间显著上调（图6F）。然而，在低氧条件下敲低HIF-1α后，LINC02776的上调幅度明显减弱（图6G–I）。在铂类耐药的OC细胞和组织中，我们还观察到HIF-1α蛋白水平显著高于铂类敏感对照组（图6J、K），这一发现与先前研究结果一致。综上所述，这些结果充分表明，HIF-1α可通过与LINC02776启动子区域的HRE位点结合，直接调控其转录，从而促成LINC02776在铂类耐药卵巢癌细胞和组织中的表达上调。

图6. LINC02776在缺氧条件下受HIF-1α转录性诱导表达

7. 靶向LINC02776可抑制卵巢癌细胞生长并逆转体内的药物耐受性

为进一步验证LINC02776在药物耐药中的关键作用，我们收集了接受肿瘤切除术或腹水引流术的卵巢癌（OC）患者的肿瘤组织和腹水样本，并成功从中建立了具有多样化药物耐药特征的患者来源类器官（PDOs）。具体而言，将肿瘤组织悬浮于基底膜提取物中，然后铺板培养于专门用于类器官生长的培养基中（如图7A、B所示）。通过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化（IHC）分析，确认PDOs中关键卵巢癌蛋白标志物（如PAX8）仍有表达。类器官的组织病理特征与其来源的原始肿瘤组织高度相似（图7C、D）。为研究LINC02776在药物耐药中的功能，我们使用携带靶向LINC02776的shRNA慢病毒感染类器官，实现高效敲低（图7E）。在顺铂或Olaparib处理后，LINC02776敲低组的类器官数量减少且体积变小（图7F–I）。使用CellTiter-Glo 3D活性检测试剂盒的结果显示，敲低LINC02776显著增强了顺铂和Olaparib的细胞毒性作用。此外，γ-H2A.X免疫染色（一种DNA双链断裂的标志）显示，敲低LINC02776的类器官中γ-H2A.X foci显著增加，提示DNA损伤修复能力受损（图7J、K）。这些结果表明，敲低LINC02776可通过抑制DNA损伤修复，提高类器官对顺铂和Olaparib的敏感性。

为进一步评估LINC02776作为抗肿瘤靶点的潜力，我们使用in vivo-jetPEI将特异性siRNA经尾静脉注射导入携带A2780异种移植瘤的小鼠体内（图8A）。在所有处理组中，siLINC02776-2 + 顺铂组显示出最显著的抗肿瘤效果，肿瘤体积和重量均显著下降（图8B–D）。qRT-PCR结果证实，在siLINC02776-2 + GS组和siLINC02776-2 + 顺铂组中，LINC02776的表达均显著降低（p = 0.0002，p < 0.0001；图8E）。进一步的IHC和免疫荧光（IF）分析显示，与对照组相比，siLINC02776-2 + 顺铂组中TUNEL检测的凋亡细胞显著增加，而增殖标志物Ki67阳性细胞数量显著减少（图8F）。这些结果表明，LINC02776敲低与顺铂治疗之间具有协同的抗肿瘤作用。为了评估联合治疗的系统毒性，我们监测了小鼠体重变化，结果各组之间无显著差异，提示在当前剂量下未观察到系统性毒性（图8G）。此外，对主要器官（心脏、肝脏、肺和肾）进行H&E染色后，未发现组织病理损伤的证据（图8H）。综上所述，我们的研究结果表明，敲低LINC02776通过破坏DNA损伤修复机制，可增强顺铂和Olaparib在类器官模型和异种移植瘤模型中的疗效。在机制上，LINC02776通过促进PARP1介导的PARylation增强DNA修复效率，从而促进卵巢癌细胞的铂类耐药性（图8I）。重要的是，LINC02776有望成为克服卵巢癌化疗耐药的潜在治疗靶点。

图7. 敲低LINC02776抑制卵巢癌（OC）细胞生长，并在卵巢癌患者来源的类器官（PDO）模型中逆转药物耐药性

研究总结