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如何利用单细胞全长转录组进行神经科学研究？
单细胞全长转录组通过长读长测序实现从基因到转录本全长的覆盖，可以分析单细胞分辨率下的Isoform、融合基因、长链非编码RNA等，在神经科学、肿瘤研究、发育生物学等领域展现出了广阔的应用前景。
接下来，我们盘点了7篇神经科学方向的单细胞全长转录组研究成果，这些成果发表在Nature Biotechnology(IF=33.1)、Nature Neuroscience(IF=21.3)、Neuron(IF=14.7)、Cell Reports(IF=7.5)等期刊上。研究涉及的组织部位主要包括大脑、小脑、脑类器官、视网膜、耳蜗等，涵盖了脑科学、视觉研究、听觉研究等多个细分领域。
案例一：单细胞全长转录组揭示了发育中及成年小鼠和人类大脑中的特定剪接模式
英文标题：Single-cell long-read sequencing-based mapping reveals specialized splicing patterns in developing and adult mouse and human brain
发表期刊：Nature Neuroscience
影响因子：21.3，一区
物种样本：小鼠、人
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1038/s41593-024-01616-4
发表时间：2024.04.09
取样策略：
单细胞全长转录组（Nanopore）：成年人海马体
单细胞全长转录组（PacBio）：小鼠出生后第14、21、28和56天的海马体和视觉皮层组织
单细胞转录组（短读长）：小鼠成年（P56）的纹状体、丘脑和小脑组织
主要研究成果：
1.细胞群体的异质性：
研究收集了小鼠出生后第14、21、28和56天的海马体和视觉皮层组织以及成年小鼠（P56）的纹状体、丘脑和小脑组织进行单细胞转录组测序。经过过滤、质量控制、短读长分析得到了204,725个细胞，平均每个样本包含约9,300个细胞，并将这些细胞归类为神经元、胶质细胞、血管细胞和免疫细胞三大类。通过可视化分析特定发育时期海马区的神经形成和少突胶质细胞成熟过程，以及P56小鼠各脑区的细胞类型分布情况，结果显示，各脑区存在区域特有的神经元群落，而胶质、免疫和血管细胞的表达模式在多数脑区较为一致，除小脑外，各样本的细胞总数和亚型分布大体一致。
2.相同细胞类型也具有独特的isoform调控机制：
“中心三角形”异构体具有独特的特性，其在发育、脑区、亚型这三个变量上均呈现出一致的变异性。这种现象在兴奋性神经元中表现得尤为突出，这意味着兴奋性神经元异构体特异性的潜在调控机制较为复杂。进一步分析显示，神经元的异构体变异性普遍高于胶质细胞和前体细胞。超过70%的基因在不同细胞类型或条件下展示出异构体使用的独立变化，而近一半的基因在三个比较维度上均表现出异构体变异性，强调了异构体表达在介导细胞和大脑区域特异性中的重要作用。
3.可变外显子组描绘了人类保守的细胞类型和大脑区域特异性剪接模式：
鉴定出4,557个高度可变外显子（hVExs， ΔΨ≥0.25），这些外显子的差异反映了细胞亚型、脑区和发育阶段的变化，进而影响如转录调控、组蛋白修饰和突触功能等生物过程。并定义了一组在细胞类型或发育阶段极端可变的外显子（EVExs， ΔΨ≥0.75），并将这些EVExs分为五组（E1-E5），每一组代表不同类型的剪接动态性。
4.发育过程中外显子变异的波动模式：
通过分析发育过程中外显子变异性的时间调控，揭示了细胞类型和大脑区域在外显子剪接中的动态变化规律。研究关注了1,072个外显子，这些外显子在不同发育阶段表现为显著的变异性变化，并归纳为9种主要的变化模式（G1至G9）。表明P21至P28是外显子变异性发生显著变化的关键时期，与细胞类型间的差异性变化紧密相关。
小鼠大脑细胞亚型按年龄和区域分配的概览
案例2 单细胞核异构体RNA测序解锁冷冻脑组织中的条形码外显子连接
英文标题：Single-nuclei isoform RNA sequencing unlocks barcoded exon connectivity in frozen brain tissue
发表期刊：Nature biotechnology
影响因子：33.1，一区
物种样本：人脑
测序策略：单细胞全长转录组
DOI：10.1038/s41587-022-01231-3
发表时间：2022.07.04
取样策略：
单细胞全长转录组：两名年龄分别为68岁和61岁的健康供体的冷冻脑组织进行了单细胞核3’端测序，利用ONT和PacBio测序。
主要研究结果：
1. 单细胞核RNA测序在基因水平上表征细胞类型。然而，与单细胞方法相比，许多单细胞核cDNA来自纯内含子区域，常规的长读长单细胞核文库缺乏条形码，阻碍了异构体的研究，本研究提出单细胞核异构体RNA测序(SnISOr-Seq)。
2. 使用微流控技术、基于PCR的伪影去除、目标富集和长读长测序，与原始长读单细胞核测序相比，SnISOr-Seq将条形码、跨越外显子的长读长精度提高了7.5倍。
3. 研究人员对成人额叶皮层进行SnISOr-Seq，发现与自闭症相关的外显子表现出协调性和高度细胞类型特异性。研究发现了两种不同的组合模式：区分了神经细胞类型，在TSS外显子、外显子多腺苷酸位点和非相邻外显子对富集，另一模式在一种细胞类型中具有多种结构在邻近的外显子对富集。
4. 此外，SnISOr-Seq可在人脑和任何冷冻或难以分离的样本中进行细胞类型特异性长读长异构体分析。
细胞的聚类分析及富集效率
案例3 小脑浦肯野细胞发育与存活受到铁死亡的调控
英文标题：Spliceosomal GTPase Eftud2 deficiency-triggered ferroptosis leads to Purkinje cell degeneration
发表期刊：Neuron
影响因子：14.7，一区
物种样本：小鼠小脑
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1016/j.neuron.2024.07.020
发表时间：2024.10.23
取样策略：
单细胞全长转录组&二代单细胞转录组：P10、P14 Ctrl和Eftud2 cKO小鼠小脑
主要研究结果：
1. 剪接体GTP酶延伸因子Tu GTP结合结构域2 (EFTUD2)是小头畸形(MFDM)综合征的致病基因，包括小脑发育不全和运动功能障碍。EFTUD2缺乏如何导致这些症状尚不清楚。
2. 该研究证明了小鼠小脑浦肯野细胞(PCs)中Eftud2的特异性消融会导致严重的铁死亡、PC变性、运动障碍和小脑萎缩，这些都是MFDM患者观察到的表型。机制上，Eftud2促进Scd1和Gch1表达，上调单不饱和脂肪酸磷脂，增强抗氧化活性，从而抑制PC铁死亡。
3. 该研究确定了转录因子Atf4作为下游靶标，以p53独立的方式调节PCsc中的抗铁死亡作用。抑制铁死亡有效地挽救了Eftud2 cKO小鼠的小脑缺陷。该研究揭示了Eftud2在维持PC存活中的重要作用，表明药理学或遗传学手段抑制铁死亡，可能为Eftud2缺陷引起的疾病提供一种有希望的治疗策略。
PCs中Eftud2的缺失会导致剪接效率受损以及转录因子Atf4中内含子2的保留
案例4 单细胞全长转录组测序技术揭示小鼠视网膜的转录组特征
英文标题：Single-cell long-read sequencing in human cerebral organoids uncovers cell-type-specific and autismassociated exons
发表期刊：Cell Reports
影响因子：7.5，一区
物种样本：人脑类器官
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1016/j.celrep.2023.113335
发表时间：2023.11.28
取样策略：
单细胞全长转录组&二代单细胞转录组：生长3-5个月的六批大脑类器官
主要研究结果：
1. 选择性剪接(AS)的失调与神经发育障碍存在多次关联，但人类神经发育中，细胞类型特异性剪接的程度在很大程度上仍然未知。
2. 在这里，研究人员进行了长读长单细胞RNA异构体测序，在人工多能干细胞(iPSC)衍生的大脑类器官中识别超过31,000个未收录的异构体和4,531个细胞类型特异性剪接事件。长读长揭示了协调剪接和细胞类型特异性的内含子保留事件，而这些是短读长测序难以研究的。
3. 被保留的神经元内含子富集于RNA剪接调控因子中，显示出更短的长度、更高的GC含量以及更弱的5'剪接位点。研究人员利用这一数据集探讨了神经系统疾病背后的生物学过程，聚焦于自闭症研究。与先前的转录组数据相比，发现自闭症大脑中的剪接程序比分化的神经元更接近祖细胞状态。
4. 此外，细胞类型特异性外显子在自闭症患者（自发突变者）中携带的全新突变显著多于其兄弟姐妹的对应外显子。总体而言，这些结果强调了细胞类型特异性剪接在自闭症和神经元基因调控中的重要性。
人脑类器官中的单细胞全长转录组揭示了以前未注释的剪接亚型
案例5 单细胞短读长和长读长测序揭示听觉和耳聋生物学见解
英文标题：Insights into the Biology of Hearing and Deafness Revealed by Single-Cell RNA Sequencing
发表期刊：Cell Reports
影响因子：7.5，一区
物种样本：小鼠耳蜗
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1101/gr.279167.124
发表时间：2019.03.12
取样策略：
单细胞全长转录组&二代单细胞转录组：p15、p30、p70和p228雄性和雌性C3HeB/FeJ小鼠
主要研究结果：
1. 单细胞RNA测序是描述低丰度细胞类型转录谱的有力工具，但其在内耳的应用受到骨迷路、组织稀疏和难以分离膜性耳蜗超稀有细胞的影响。
2. 在这里，研究人员提出了一种可在小鼠出生后的任何时间从耳蜗中分离单个内毛细胞（inner hair cells，IHC）、外毛细胞（outer hair cells，OHC）和Deiter细胞(deiters’cell，DC)的方法。
3. 从出生后的15天(P15)到228天(P228)的小鼠耳蜗采集了200多例IHC、OHC和DC样本，并利用短读长和长读长单细胞RNA测序分析了转录本的丰度和结构。
4. 本研究提供了对这些细胞的表达谱的深入了解，并记录了耳聋相关基因异构体多样性中未被认识到的复杂性。这种在Corti器官中转录的精细观点提高了我们对听力和耳聋生物学的理解。
单细胞异构体定量
案例6 单细胞全长转录组测序技术揭示小鼠视网膜的转录组特征
英文标题：Integrating short-read and long-read single-cell RNA sequencing for comprehensive transcriptome profiling in mouse retina
发表期刊：Genome Research
影响因子：6.1，一区
物种样本：小鼠视网膜
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1101/gr.279167.124
发表时间：2025.03.06
取样策略：
单细胞全长转录组（Nanopore）&二代单细胞转录组：四个小鼠视网膜样本
主要研究结果：
1. 人类基因组中的绝大多数蛋白质编码基因通过选择性剪接产生多种mRNA亚型，显着增强了转录组和蛋白质组的复杂性。
2. 为了建立一种表征组织样品中转录异构体的有效方法，本研究对单细胞长读长和常规短读长RNA测序技术进行了系统比较。使用15.4亿个Illumina短读长和14.0亿个Oxford Nanopore Technologies长读长对大约30,000个小鼠视网膜细胞的转录组进行了分析。鉴定了44,325个转录异构体，其中38%以前未表征，17%仅在不同的细胞亚类中表达。
3. 研究发现，长读长测序不仅与短读长测序的基因表达和细胞类型注释性能相匹配，而且在转录本亚型的精确鉴定方面表现更加出色。虽然转录本亚型通常在各种细胞类型中普遍存在，但它们的相对丰度显示出相当大的细胞类型特异性变异。
4. 本研究产生的数据显着增强了转录本亚型的现有数据库，从而为未来研究视网膜生物学中可变剪接的机制和影响，及其与相关疾病的联系奠定了重要的数据基础。
实验设计流程和Illumina短读长（SR）与ONT长读长（LR）数据统计结果
案例7 单细胞全长转录组揭示自闭症谱系障碍在大脑皮层发育过程中的转录失调
英文标题：Single-Cell full-length Isoform Sequencing Unveils Transcriptional Dysregulation in Autism Spectrum Disorder During Cerebral Cortex Development
发表期刊：bioRxiv
物种样本：小鼠胚胎前额叶皮层
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：https://doi.org/10.1101/2024.12.04.626807
发布时间：2024.12.04
取样策略：
单细胞全长转录组（Nanopore）&二代单细胞转录组：C57BL/6和BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR)小鼠E13.5、E15.5和E17.5胚胎前额叶皮层，通过子宫内注射4-硫尿苷（4sU）标记新生RNA，捕获转录动态
主要研究结果：
1. RNA剪接调控在神经发育中起着至关重要的作用，并已建立了基因Isoform的表达模式。然而，不同细胞类型中Isoform多样性在健康和疾病状态下的具体功能仍需进一步研究。
2. 本研究中，研究人员结合了4-硫尿苷（4sU）代谢RNA标记和基于长读长测序的单细胞全长转录组测序，捕获了发育中的小鼠大脑皮层中新合成的转录本。这种方法能够通过新生RNA识别特定的细胞状态，以及调控深层和上层神经元发育的关键转录因子亚型。
3. 通过详细的单细胞Isoform表达分析，研究人员发现了新的细胞类型特异性Isoform，并揭示了调节神经元分化的亚型转换事件。此外，研究人员还研究了与自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）相关的小鼠胚胎发育期间的Isoform调控，尤其是在BTBR T+ Itpr3tf（BTBR）小鼠中的表现。值得注意的是，研究发现自闭症受累皮质中皮层投射神经元（CPNs）的过早出现，其身份未完全成熟。这些CPNs表现出最高水平的差异性转录本使用（DTU），显著与其细胞类型标记基因重叠，并富集于RNA剪接过程。
4. 此外，在自闭症中，Exon inclusion显著增多，相关的RNA结合蛋白（RBPs）中，有近60%已被报道为自闭症风险基因。
5. 最后，本研究揭示了自闭症中Isoform多样性的减少，这可能与相关基因中H3K27ac失调有关。总体而言，本研究在理解皮层发育和功能的分子基础方面取得了重大进展，并为神经发育障碍的后续研究铺平了道路。
发育中小鼠大脑皮层的研究和细胞类型分析
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