2025年2月，来自中山大学中山医学院的王金凯团队在《Molecular Cell》期刊(IF=14.5)上发表了题为“Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms”的研究论文。该研究构建开发了一种基于内源性标记的检测算法模型m6Aiso，通过内源性标记m6A修饰结合纳米孔直接RNA测序，能够在单分子水平上准确识别和量化m6A修饰，揭示了RNA异构体上m6A修饰的复杂性和动态性。

贝纳基因在该项研究中承担了直接RNA测序工作。

研究结果

1. 单分子m6A检测模型算法m6Aiso构建

为了确定单个RNA分子上的m6A修饰情况，利用APOBEC1-YTH融合蛋白诱导的C-to-U突变对m6A位点进行内源性标记，并通过DRS技术分析单个RNA分子的序列信息及其突变位点，以确定单个分子上的m6A信号（图1A）。随后采用半监督学习策略，通过多次迭代过滤假阳性信号，优化训练数据模型，成功开发构建了m6Aiso模型算法（图1B）。与多种已知的实验方法和算法工具相比，该模型预测的修饰概率集中在未修饰和修饰reads的极端值上（图1C），表明m6Aiso能够有效区分修饰和未修饰的reads，即准确识别和量化单个RNA分子上的m6A修饰。

图1：单分子m6A检测模型算法m6Aiso构建

2. m6Aiso准确识别和定量m6A位点

进一步利用m6Aiso模型识别HEK293T细胞中的m6A位点，以验证m6Aiso的准确性和可靠性，结果显示m6Aiso在HEK293T细胞中鉴定的m6A位点在终止密码子附近高度富集，呈现典型的分布模式（图2A）。其次，比较m6Aiso与GLORI在DRACH motif上识别的修饰位点比例发现两者具有高度一致性，初步验证了m6Aiso的准确性（图2B）。

比较不同方法识别的m6A修饰水平分布和位点交集情况显示，m6Aiso更容易检测到低甲基化的m6A位点（图2C），并且大多数m6Aiso识别的位点可被GLORI、miCLIP等其他方法验证（图2D）。此外，比较m6Aiso与GLORI在HEK293T 细胞和小鼠胚胎干细胞（mESCs）中m6A水平的相关性，结果显示两者具有显著相关性（图2E~F），与iM6A预测的m6A概率也具有显著相关性（图2G），同时，m6Aiso识别的特有位点的iM6A得分显著低于共有位点（图2H）。在上述两种细胞中敲除METTL3后，大多数m6A位点的甲基化水平均发生下降，再次验证了m6Aiso的准确性（图2I~J）。以上表明，m6Aiso能够准确识别和定量RNA的m6A修饰，为研究m6A的功能和机制提供了有力工具。

图2：m6Aiso准确识别和定量m6A位点

3. m6A位点在单个RNA分子上的分布和连锁关系

通过比较单reads以及isoform和基因水平上具有不同数量m6A位点的比例，发现单reads上存在至少两个m6A位点的比例较低（图3A）。进一步分析显示，约35%的m6A修饰在基因和isoform水平上是聚集的，然而在单reads水平上只有少数位点是聚集的（图3B）。计算不同基因组距离的m6A位点对的连锁D’值，发现距离小于200bp的m6A位点对存在较弱但显著的连锁关系（图3C）。此外，高度连锁的m6A位点对倾向于位于较长的外显子上，且距离外显子连接较远（图3D）；同时比较在RNA上距离小于50 bp但在基因组上距离大于5kb的m6A位点对与在RNA和基因组上距离都小于50bp的m6A位点对的D’值，发现前者具有显著较小的D’值（图3E）。分析STIP1-201转录本上的m6A位点，发现某些m6A位点在RNA 分子上倾向于共同出现，进一步说明了m6A位点在单个RNA分子上的连锁关系（图3F）。以上表明，m6A位点在单个RNA 分子上的分布和连锁关系受到基因组距离和外显子结构的影响。

图3：m6A位点在单个RNA分子上的分布和连锁关系

image.png 图2：m6Aiso准确识别和定量m6A位点 3. m6A位点在单个RNA分子上的分布和连锁关系 通过比较单reads以及isoform和基因水平上具有不同数量m6A位点的比例，发现单reads上存在至少两个m6A位点的比例较低（图3A）。进一步分析显示，约35%的m6A修饰在基因和isoform水平上是聚集的，然而在单reads水平上只有少数位点是聚集的（图3B）。计算不同基因组距离的m6A位点对的连锁D’值，发现距离小于200bp的m6A位点对存在较弱但显著的连锁关系（图3C）。此外，高度连锁的m6A位点对倾向于位于较长的外显子上，且距离外显子连接较远（图3D）；同时比较在RNA上距离小于50 bp但在基因组上距离大于5kb的m6A位点对与在RNA和基因组上距离都小于50bp的m6A位点对的D’值，发现前者具有显著较小的D’值（图3E）。分析STIP1-201转录本上的m6A位点，发现某些m6A位点在RNA 分子上倾向于共同出现，进一步说明了m6A位点在单个RNA分子上的连锁关系（图3F）。以上表明，m6A位点在单个RNA 分子上的分布和连锁关系受到基因组距离和外显子结构的影响。

为了揭示不同RNA isoform上m6A修饰的差异，基于m6Aiso深入分析HEK293T细胞中的m6A位点，发现m6Aiso鉴定的isoform m6A水平与APOBEC1-YTH诱导的C-to-U突变水平具有显著正相关性，说明m6Aiso能够准确反映isoform上的m6A修饰情况（图4A）。进一步分析显示，m6A修饰水平在外显子连接附近受到抑制，尤其是在距离外显子连接200bp以内的区域，m6A修饰水平显著降低（图4B）；并且在相同基因的不同isoform上，相同m6A位点的甲基化水平存在显著差异，其中存在内含子保留的isoform上的m6A位点倾向于高甲基化，这些位点往往距离外显子连接较远（图4C~E），可能与外显子连接复合物（EJC）对m6A沉积的抑制作用有关。此外，TARBP2结合的内含子可以促进其相邻外显子上的m6A沉积，导致这些isoform上的m6A修饰水平显著高于其他isoform，说明TARBP2也可能通过促进m6A沉积影响isoform特异性的m6A修饰（图4F-K）。以上表明，m6A修饰在不同isoform上的差异受到包括EJC和TARBP2作用等多种机制的调控。

图4：不同RNA isoform上m6A修饰的差异

5. 上皮间质转化过程中的m6A修饰的动态变化

为了探究TGF-β诱导的上皮间质转化（EMT）过程中m6A修饰的动态变化，使用TGF-β诱导处理HeLa细胞并进行DRS和m6Aiso分析。结果显示，对照组和TGF-β处理组之间m6A位点大多数为共有，并且均在终止密码子附近高度富集，说明m6A修饰在EMT过程中具有一定的保守性（图5A~B）。此外，TGF-β处理后，细胞中m6A修饰水平显著增加，说明EMT过程中m6A修饰整体上调（图5C）。

进一步分析发现，多个差异甲基化位点在基因水平上变化并不明显，在isoform水平上具有显著差异，表明m6A修饰的变化具有isoform特异性（图5D~E）。GO富集分析显示，上调m6A位点的isoform主要参与EMT相关的生物学过程，如TGF-β信号通路和Wnt信号通路的调节（图5F）。与基因水平相比，isoform水平的m6A分析能够揭示更多细微的变化，尤其是那些低表达的isoform（图5G）。通过比较同一基因的不同isoform上相同m6A位点的甲基化水平变化，发现这些位点在不同isoform上具有显著差异，进一步证实了m6A修饰在EMT过程中的isoform特异性动态变化（图5H~J）。以上表明，m6A修饰在EMT过程中以isoform特异性的方式动态变化，可能在调控EMT相关基因表达中发挥重要作用。

图5：上皮间质转化过程中的m6A修饰的动态变化

6. SMAD3选择性促进具有可变启动子的isoform上的m6A修饰

已有研究报道，在人胚胎干细胞（hESCs）中，当受到TGF-β信号刺激时，转录因子SMAD2/3会发生磷酸化，并招募m6A甲基转移酶复合物（MTC）来促进m6A甲基化。对m6A修饰变化分析发现，上调m6A位点的isoform的启动子区域显著富集SMAD3的结合motif，说明SMAD3可能直接参与这些位点的m6A修饰（图6A）。进一步的实验证明SMAD3与m6A甲基转移酶复合物的关键成分（METTL3、METTL14和WTAP）之间存在相互作用，并且这种相互作用可能促进m6A的沉积（图6B）。

此外还发现存在可变启动子的isoform在EMT过程中m6A修饰的变化尤为显著，并且其中m6A修饰上调的isoform在启动子区域更易富集SMAD3 motif，修饰位点的分布情况与已有研究也较为一致（图6C~F）。以上表明，转录因子SMAD3在EMT过程中通过选择性结合特定启动子区域，促进其转录的RNA isoform上的m6A沉积。

图6：SMAD3选择性促进具有可变启动子的isoform上的m6A修饰

研究总结

本研究开发了基于内源性标记的深度学习模型m6Aiso，实现了从单分子水平上准别识别m6A修饰，并揭示了m6A修饰在RNA异构体上的分布和水平差异及其特异性调控机制。这些发现不仅深化了对m6A修饰在RNA异构体上动态变化的理解，还为研究m6A修饰在基因表达调控中的作用提供了新的视角和工具，对于揭示m6A修饰在生物学过程中的功能具有重要意义。

参考文献：

Guo W, Ren Z, Huang X, et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms[J]. Molecular Cell, 2025.