英文标题：Quantitative RNA pseudouridine maps reveal multilayered translation control through plant rRNA, tRNA and mRNA pseudouridylation

发表期刊：Nature Plants

发表时间：2025.1.9（IF：15.8）

通讯作者：Professor Chuan He，美国芝加哥大学

研究背景

假尿嘧啶（Pseudouridine, Ψ）是RNA分子中的极为丰富的转录后修饰形式，广泛存在于rRNA、tRNA和mRNA中。Ψ修饰通过改变RNA的局部结构，影响RNA稳定性、核糖体功能及翻译效率，在真核生物的生命活动中具有重要的调控作用。例如，rRNA的Ψ修饰可调节核糖体活性，tRNA的Ψ修饰影响密码子识别效率，而mRNA的Ψ修饰可能通过改变翻译动力学影响蛋白质合成。然而，在植物领域，针对Ψ修饰的系统性研究却长期受限，主要原因包括：（1）缺乏高分辨率、定量化的检测方法；（2）植物特异性Ψ修饰酶的功能尚不明确；（3）不同RNA分子（rRNA、tRNA、mRNA）中Ψ修饰的协同调控机制未被阐明。

传统检测方法（如CMC化学标记法）灵敏度低且达到单碱基分辨率，难以满足深入研究的需求。近年来发展的Bisulfite-induced deletion sequencing（BID-seq）技术通过检测硫酸氢盐诱导的缺失信号，能够以单碱基精度绘制Ψ修饰图谱，并量化修饰化学计量。本研究利用BID-seq技术，首次在拟南芥、水稻、玉米和大豆等多种植物中系统绘制了rRNA、tRNA和mRNA的Ψ修饰图谱，结合多聚体分析和翻译效率评估，揭示了Ψ修饰在植物翻译调控中的多层次作用，为植物转录后修饰领域的研究开辟了新的方向。

技术路线

1. 样本设计与处理

植物物种：选择拟南芥（模式植物）、水稻（单子叶代表）、玉米（重要农作物）和大豆（双子叶豆科）作为研究对象，覆盖单子叶与双子叶植物。

组织类型：采集拟南芥9种组织（幼苗、根、莲座叶等）和水稻10种组织（胚芽、胚根、穗等），覆盖植物全生命周期。

2. Ψ修饰检测与定量

BID-seq技术：基于硫酸氢盐处理诱导Ψ位点的特异性缺失，通过高通量测序检测缺失信号，结合校准曲线计算Ψ修饰化学计量（Ψ分数）。

LC-MS/MS验证：采用液相色谱-串联质谱法测定poly(A) RNA中Ψ与U的比例，验证测序数据的可靠性。

3. 功能关联分析

多聚体分析：通过蔗糖密度梯度离心分离核糖体结合mRNA，结合RNA-seq数据计算翻译效率（TE）。

进化保守性分析：比较四种植物的rRNA和tRNA Ψ位点，识别保守修饰位点及其功能关联。

组织特异性分析：利用GO富集和聚类方法，解析mRNA Ψ位点的组织特异性分布及其生物学意义。

研究结果

1. rRNA Ψ修饰的进化保守性与全局翻译调控

通过 BID-seq 对多种植物的 rRNA 进行高分辨率图谱绘制，发现 rRNA 的 Ψ 修饰在不同植物物种中具有一定的保守性。在核编码的 rRNA（Nu-18S、Nu-5.8S、Nu-25S）、线粒体编码的 rRNA（Mt-26S、Mt-18S、Mt-5S）和叶绿体编码的 rRNA（Pt-16S、Pt-23S、Pt-4.5S、Pt-5S）中均检测到 Ψ 修饰位点（图 1a）。例如，在水稻、玉米、拟南芥和大豆中分别鉴定出 129、121、134 和 116 个 rRNA Ψ 位点，且核编码的 rRNA 中 Ψ 位点更为富集。同时，发现一些假尿苷合成酶在 rRNA Ψ 修饰中发挥重要作用，如 SVR1 可在水稻叶绿体编码的 23S rRNA 的特定位置（Pt-23S:Ψ2,702）添加 Ψ修饰，该位点在多个植物物种中均较为保守（图1b-e）。

图1 BID-seq 揭示了单子叶植物和双子叶植物 rRNA 中在进化上保守的假尿苷化修饰

2. Ψ 修饰对翻译的调控作用

rRNA Ψ 修饰位点的化学计量比会影响翻译效率，不同的 Ψ 修饰位点对翻译效率的影响各不相同。总体而言，约 55.9% 的 rRNA Ψ 位点与翻译效率呈负相关，44.1% 呈正相关（图 2h）。进一步研究发现，mRNA 转录本的结构特征与 rRNA Ψ 位点的作用相关。具有较长 5′非翻译区（UTR）的 mRNA 转录本，其翻译效率与 rRNA 起始区域（如 Nu-18S:913）的 Ψ 修饰水平呈现出更强的正相关；编码序列（CDS）较长的 mRNA 转录本，其翻译效率与 rRNA 解码区域（如 Nu-18S:1,195）的 Ψ 修饰水平呈现出更强的正相关（图2i）。

图2 rRNA 修饰位点的 Ψ 化学计量比会影响不同组织中的翻译过程

3. tRNA Ψ 修饰与翻译效率的关系

在拟南芥中，tRNA 的 Ψ 修饰与翻译效率存在关联。tRNA T-臂环区域的 Ψ 化学计量比与相应密码子的翻译效率呈强正相关（图 3a、b），反密码子臂环和 D-臂环中的 Ψ 与翻译效率也有正相关，但强度较弱，而在茎区域则无明显相关性。这表明在调节蛋白质生物合成或翻译过程中，tRNA的环区域可能比茎区域更关键。

图3 tRNA 上的假尿苷（Ψ）化学计量比会影响不同植物组织中的翻译过程

4. mRNA Ψ 修饰位点的分布与特征

在不同植物物种的 mRNA 中鉴定出大量 Ψ 修饰位点，但这些位点在植物物种间几乎没有保守性。大部分 Ψ 位点高度富集在 CDS 区域，其次是 3’-UTR 和 5’-UTR（图 4a-c）。不同植物物种的 mRNA Ψ 修饰基序存在差异，如水稻、大豆和拟南芥中最富集的基序是 CΨC，而玉米中 GΨG 基序则更为富集（图 4d）。

图4 BID-seq 在不同植物物种中鉴定出大量的 mRNA 假尿苷（Ψ）位点

5. mRNA Ψ 修饰的组织特异性及与 mRNA 的关系

mRNA Ψ 修饰在不同组织间存在差异。通过 LC-MS/MS检测发现，不同组织中 mRNA 的 Ψ 与 U 的比例变化较大，且大部分 Ψ 位点的修饰比例较低（<20%）。不同组织中存在较多特异性的 Ψ 位点，这些位点可能在组织分化和发育中发挥作用。例如，拟南芥种子特异性的 Ψ 位点在种子成熟途径中显著富集（图 5e），水稻胚胎中特异性的 Ψ 位点在胚胎后植物器官发育过程中富集（图 5f）。

在拟南芥幼苗中，较高的 mRNA Ψ 修饰比例与较低的 mRNA 稳定性相关，5’-UTR 的 Ψ 位点对 mRNA 稳定性影响更明显（图 6a、b）。然而，mRNA Ψ 水平与翻译效率呈正相关，且 5’-UTR 有 Ψ 修饰的转录本与翻译效率的相关性更显著（图 6c、d）。GO 富集分析表明，3’-UTR Ψ 相关的 mRNA 在光合作用相关途径中特异性富集，5’-UTR Ψ 相关的 mRNA 则参与多种刺激响应过程（图 6e、f）。

图5 水稻和拟南芥中 mRNA 假尿苷（Ψ）位点的全面碱基分辨率图谱

图6 Ψ 修饰影响拟南芥幼苗中 mRNA 的稳定性和翻译过程

研究结论

本研究使用 BID-seq 技术绘制了多种植物不同组织的 RNA Ψ 修饰图谱，揭示了植物中 rRNA、tRNA 和 mRNA 的 Ψ 修饰对翻译的多层调控机制。这些发现为深入理解植物 RNA Ψ 修饰的功能提供了重要依据，也为后续研究植物生长发育过程中的转录后调控机制奠定了基础。

参考文献

Li H, et al. Quantitative RNA pseudouridine maps reveal multilayered translation control through plant rRNA, tRNA and mRNA pseudouridylation Nature Plants. 2025

doi:10.1038/s41477-024-01894-7