提问 解答

1. 单细胞全长转录组可以发什么文章？

单细胞全长转录组能发什么样的文章？

现在发的单细胞全长转录组文章，有影响因子的只有几十篇，其中三分之二的影响因子都在 10 以上。这些文章大多是关于人和小鼠的，大部分是讲方法的文章。而且很多领域都还没有相关研究发表。

为啥二代单细胞转录组做不了后面这些分析啊？

这是因为二代单细胞转录组测序一般用 PE150 测序技术，read 1用来拆分细胞 Barcode 和 UMI，read 2做比对分析。就拿 10× 单细胞转录组测序来说，一个转录本真正用来分析的只有 91bp，还不到 100bp，这么短的片段只能给基因定量。单细胞全长转录组就不一样了，它测的是全长转录本，所以能做：可变剪接、融合基因，并基于差异转录本对细胞进行分群。

2. 单细胞全长转录组和二代单细胞转录组在分析这块有什么区别？

单细胞全长转录组和二代单细胞转录组在分析这块有什么区别？

二代单细胞转录组测序只能分析基因表达定量。单细胞全长转录组可不止分析基因表达，它还能分析可变剪接、融合基因，更重要的是对Isoform鉴定和定量。

为啥二代单细胞转录组做不了后面这些分析啊？

这是因为二代单细胞转录组测序一般用 PE150 测序技术，read 1用来拆分细胞 Barcode 和 UMI，read 2做比对分析。就拿 10× 单细胞转录组测序来说，一个转录本真正用来分析的只有 91bp，还不到 100bp，这么短的片段只能给基因定量。单细胞全长转录组就不一样了，它测的是全长转录本，所以能做：可变剪接、融合基因，并基于差异转录本对细胞进行分群。

3. 单细胞全长转录组的实验处理和二代单细胞转录组有什么不同？

单细胞全长转录组和二代单细胞转录组实验处理有啥不一样的地方呢？

在10× genomics平台上的处理步骤是一样的，需要进行单细胞解离、油滴包裹、逆转录和PCR 扩增，获得带有细胞 Barcode 和 UMI序列的全长cDNA。二代单细胞转录组，首先对全长cDNA进行酶解，通过富集 3' 或者 5' 末端的序列再去做二代测序。

单细胞全长转录组，则是直接对全长cDNA进行测序，这样就能得到全长转录本，可进行可变剪接、融合基因等分析。

4. 单细胞全长转录组 2020 年就有文章了，现在文章为什么还是这么少？

单细胞全长转录组 2020 年就有文章发表了，为啥到现在相关文章还这么少啊？

一方面是因为以前测序太贵了，不管是单细胞处理，还是长读长测序，像 PacBio 和 ONT 测序，费用都高，所以前几年做的项目不多。另一方面，前几年普通单细胞转录组的文章好发，很多老师就没考虑做单细胞全长转录组。

为什么说现在是做单细胞全长转录组最好的时机？

现阶段，单细胞处理的价格大幅降低，ONT测序的准确度大幅提升，SUP basecall模式准确度达到Q20以上，UMI 和细胞 Barcode 拆分效率达到70%，单细胞全长转录组测序成本大大降低，所以说现在是开展单细胞全长转录组测序最好的时机。

5. 单细胞全长转录组测序 ONT 测序为什么一定要用 SUP 模式进行 Basecall？

为啥单细胞全长转录组用 ONT 测序的时候，一定要用 SUP 模式进行 Basecall 呢？

ONT有3种Basecall的模式，以人的cDNA测序为例：Fast模式，错误率最高，不考虑使用；HAC模式次之，1%左右水平；SUP模式最低0.3%左右。因此推荐选择SUP模式进行Basecall。



错误率高有啥影响呢？

错误率越高，对细胞 Barcode 和 UMI 的拆分就越不利，数据能用的部分就少了。用 SUP 模式的话，数据的使用率提高，同样的测序数据量能得到更多有效结果，并且成本增加不多。

6. 单细胞全长转录组测序方式，用PacBio 测序，ONT 测序有什么区别？

PacBio 测序和 ONT 测序在单细胞全长转录组测序里有啥不一样啊？

从性价比来说，ONT 更划算，它单条 reads 的成本差不多是 PacBio 的五分之一，甚至更低。从reads覆盖范围来看，PacBio没办法测到短的序列，但 ONT 既能测小于 200bp 的，也能测大于 5K 的序列。

要是我想做定量分析，选哪个好呢？

要是考虑定量分析的话，更建议选 ONT。PacBio 测序 reads 的成本是 ONT 的 4 - 5 倍，单细胞全长转录组测序时，ONT 每 M reads 100 多块钱，PB 要 500 左右。要是不关注定量，经费又充足，选哪个平台就没太大差别。但要是关注短序列，那么还是 ONT 更合适。

7. 单细胞全长转录组分析是否需要二代数据？

单细胞全长转录组分析需不需要二代数据辅助呢？

其实现在数据分析不太依赖二代数据了。在 2020 - 2023 年的时候，用 ONT 平台做单细胞全长转录组测序，错误率高，UMI 和细胞 Barcode 拆分效率低，所以得先测二代数据，构建Barcode和UMI的数据库，来辅助 ONT 数据拆分。但 2024 年 5 月之后，ONT 测序 SUP 模式错误率降到 0.3% 左右，Barcode 和 UMI 的拆分效率也到 70% 左右了，就不需要二代数据辅助分析了。

那还有必要测二代数据吗？

虽然不是必须的，但是建议你还是测一下。从发文章的角度看，单细胞全长转录组是新技术，发表文章的时候最好和以前的技术对比一下。要是有同样的样品做对比，数据就更有说服力。要是你不想测二代数据，发文章的时候可以用已发表的相同样品类型的数据来对比。现在二代测序也不贵，做项目的时候可以顺便测个 100G 左右的二代数据。

8. 单细胞全长转录组测序贝纳基因有什么优势？

贝纳基因做单细胞全长转录组测序有啥厉害的地方吗？

贝纳基因是亚太地区最大的 ONT 测序服务商，对全长转录组测序和相关衍生技术特别成熟。从 2021 年开始，贝纳基因就在不断改进单细胞全长转录组技术。现在单细胞处理技术大家都差不多了，难点在于实验处理中的多轮 PCR 扩增会让转录本断裂，影响细胞 Barcode 和 UMI 的拆分。贝纳基因不断改进实验流程，通过对全长cDNA进行富集，现在有效数据能达到 70% 左右了。而且他们已经有单细胞全长转录组的文章在返修，听说今年可能会有一篇发在NC上，有 6 个样品的数据。