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破解癌症密码！单细胞全长转录组如何颠覆肿瘤研究？
单细胞全长转录组通过长读长测序实现从基因到转录本全长的覆盖，可以分析单细胞分辨率下的Isoform、融合基因、长链非编码RNA等，在神经科学、癌症研究、发育生物学等领域展现出了广阔的应用前景。
小编盘点了8篇癌症研究方向的单细胞全长转录组研究成果，这些成果发表在Nature Communications(IF=14.7)、Cell Genomes(IF=11.1)、Genome Research(IF=6.2)、bioRxiv等期刊上。研究涉及的癌症类型包括肾细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌、结直肠癌、垂体神经内分泌瘤、慢性淋巴细胞白血病、小儿T细胞急性淋巴细胞白血病等。
案例1 剪接多样性增强了垂体神经内分泌肿瘤的分子分类
英文标题：Splicing diversity enhances the molecular classification of pituitary neuroendocrine tumors
发表期刊：Nature Communications
影响因子：14.7，一区
物种样本：人垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）
测序策略：转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1038/s41467-025-56821-x
发表时间：2024.02.11
取样策略
单细胞全长转录组：14例垂体神经内分泌肿瘤患者和2例正常样本
二代转录组：264例垂体神经内分泌肿瘤患者和4例正常样本，另有180例垂体神经内分泌肿瘤患者作为验证队列
主要研究成果
1. 垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）是最常见的颅内肿瘤之一，临床表现多样。目前的病理分类系统主要依赖于组织学激素染色和转录因子（TFs）的表达。尽管这些方法能有效识别三大主要谱系，但是基于激素和转录因子的分子特征分辨率不足，难以全面捕捉复杂的肿瘤异质性。可变剪接（AS）产生的转录多样性为解决异质性提供了新视角。
2. 研究人员通过对264例PitNET患者和4例正常样本进行bulk RNA测序，以及对14例PitNET患者和2例正常样本进行单细胞全长转录组测序，全面调查了所有PitNET谱系中的选择性剪接（AS）失调情况。结果显示，广泛的剪接失调事件能更精细地描绘肿瘤异质性。同时，在单细胞分辨率下揭示了肿瘤细胞间的基础剪接异质性，不仅验证了批量测序结果，还进一步明确了不同肿瘤细胞类型间差异性的剪接失调模式。值得注意的是，本研究有效地区分了沉默性促肾上腺皮质激素亚型，并定义了一个独特的TPIT谱系亚型，该亚型与较差的临床预后相关，其剪接异常的增加由ESRP1表达异常驱动。
3.可变外显子组描绘了人类保守的细胞类型和大脑区域特异性剪接模式：鉴定出4,557个高度可变外显子（hVExs，ΔΨ≥0.25），这些外显子的差异反映了细胞亚型、脑区和发育阶段的变化，进而对转录调控、组蛋白修饰和突触功能等生物过程产生影响。并定义了一组在细胞类型或发育阶段极端可变的外显子（EVExs，ΔΨ≥0.75），并将这些EVExs分为五组（E1-E5），每一组代表不同类型的剪接动态性。
4. 综上所述，本研究系统解析了PitNETs亚型特异性的可变剪接图谱，深化了对肿瘤异质性的理解，为精准分型提供了新依据。
英文标题：An isoform-resolution transcriptomic atlas of colorectal cancer from long-read single-cell sequencing
发表期刊：Cell Genomics
影响因子：11.1，一区
物种样本：人结直肠癌（CRC）
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1016/j.xgen.2024.100641
发表时间：2024.09.11
取样策略
单细胞全长转录组&二代单细胞转录组：12例结直肠癌患者癌和癌旁组织。
主要研究结果
1. 结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第二大癌症死亡原因。近年来，短读长单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术在解析肿瘤异质性方面发挥了重要作用，但这些研究仅能实现基因水平的定量，无法捕捉由可变末端加工或剪接引起的转录本结构变化。
2. 本研究通过整合结直肠癌样本的短读长与长读长单细胞RNA测序数据，构建了首个异构体分辨率的结直肠癌转录组图谱。研究发现肿瘤上皮细胞中存在394种失调的转录本结构，其中299种由多种剪接事件组合形成；系统解析了与上皮细胞谱系及不同预后亚群相关的基因及异构体特征。
3. 此外，在31,935个含新型剪接位点的异构体中，330种通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）RNA-seq与质谱数据联合验证；开发了新型算法，通过整合复发性肿瘤特异性转录本开放阅读框（ORF）来源的新肽段与质谱数据，鉴定出可复现的新抗原表位，为癌症疫苗研发提供潜在靶点。总之，该研究为结直肠癌分子机制的探索及精准诊疗策略的开发提供了转录本层面的新见解。
人类CRC的长读长单细胞转录组图谱[2]
案例3 单细胞长读长靶向测序揭示卵巢癌的转录变异
英文标题：Single-cell long-read targeted sequencing reveals transcriptional variation in ovarian cancer
发表期刊：Nature Communications
影响因子：14.7，一区
物种样本：卵巢癌细胞系混合物、卵巢分离肿瘤细胞
测序策略：单细胞全长转录组
DOI：10.1038/s41467-024-51252-6
发表时间：2024.08.12
取样策略
单细胞全长转录组：三种人类卵巢癌系（SK-OV-3、COV504和IGROV-1）的等量混合物、卵巢癌组织分离的肿瘤细胞
主要研究结果
1. 单细胞RNA测序技术主要依赖短读长测序来解析细胞类型、状态及动态变化，但其对RNA异构体的全面解析能力有限。长读长测序技术虽能实现单细胞RNA异构体检测，却受限于通量较低且易产生非特异性测序产物。
2. 本研究开发了单细胞靶向异构体长读长测序技术（scTaILoR-seq），该杂交捕获方法可靶向富集超过一千个目标基因，使单细胞中靶标转录本的中位数提升29倍。研究人员应用该技术对卵巢癌细胞系和原发肿瘤样本进行RNA异构体鉴定与定量分析，成功获得10,796单个细胞的转录组。通过长读长变异检测，研究人员揭示了表达型单核苷酸变异（SNVs）与选择性转录本结构的关联性。跨转录本的SNVs相位分析实现了不同细胞群体内等位基因失衡的精准测量。
3. 总体而言，scTaILoR-seq作为一种靶向长读长RNA测序技术及配套分析框架，为单细胞水平的转录变异研究提供了创新解决方案。
用scTaILoR-seq对卵巢肿瘤细胞进行分析[3]
案例4 高通量全长单细胞RNA测序识别卵巢癌转录本和基因组变化
英文标题：Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-length single-cell RNA sequencing in ovarian cancer
发表期刊：Nature Communications
影响因子：14.7，一区
物种样本：人卵巢癌
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1038/s41467-023-43387-9
发表时间：2023.11.27
取样策略
单细胞全长转录组&二代单细胞转录组：三名出现大网膜转移的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者的肿瘤和癌旁配对样本
主要研究结果
1. 癌症是一种复杂的疾病，其特点是基因组和转录组的改变，这些变化包括基因组水平上的点突变、插入和缺失、基因融合，以及转录组水平上的剪接异构体。检测这些变化在个性化肿瘤治疗方面具有巨大潜力，因为它们可以作为直接的治疗靶点或用于评估肿瘤的免疫原性。要深入解析癌症的复杂生物学背景，需在单细胞层面获取基因型与表型信息。
2. 本研究对三例伴有网膜转移的卵巢癌患者临床样本开展长读长单细胞RNA测序（scRNA-seq），测序深度提升至每个细胞12,000条reads。研究共捕获15.2万个Isoforms，其中超过5.2万个为首次报道。对非编码异构体的转录本水平分析中，发现蛋白编码基因表达量平均被高估20%。研究人员鉴定出肿瘤细胞与间皮细胞中细胞类型特异性的异构体及多聚腺苷酸化位点使用模式，并揭示间皮细胞通过TGF-β/miR-29/胶原蛋白轴等机制向癌症相关成纤维细胞转化的过程。
3. 此外，本研究还发现包括实验验证的IGF2BP2::TESPA1融合基因在内的基因融合事件（该事件在匹配的短读长数据中被误判为TESPA1高表达），并通过靶向测序癌症基因组合检测结果验证了突变位点。基于上述发现，预见长读长单细胞RNA测序技术将在肿瘤学与精准医疗领域发挥日益重要的作用。
长读长scRNA序列创建了卵巢癌患者来源组织样本中的异构体目录[4]
案例5 高通量单细胞长读长测序分析人类肿瘤中同一细胞基因型和表型
英文标题：High throughput single cell long-read sequencing analyses of same-cell genotypes and phenotypes in human tumors
发表期刊：Nature Communications
影响因子：14.7，一区
物种样本：4种肿瘤和2种细胞系
测序策略：单细胞全长转录组
DOI：10.1038/s41467-023-39813-7
发表时间：2023.07.11
取样策略
单细胞全长转录组：收集肾细胞癌(RCC)和黑色素瘤(MEL)患者的4个冷冻肿瘤样本，以及A375和H2030两种癌细胞系。
主要研究成果
1. 全长mRNA的单细胞纳米孔测序推动了单细胞多组学研究的发展。然而，该技术面临着测序错误率高和对短读长和/或条形码白名单的依赖等问题。
2. 为了解决这些问题，本研究开发了scNanoGPS来计算同细胞基因型（突变）和表型（基因/亚型表达），而无需短读长或白名单指导。将scNanoGPS应用于来自4个肿瘤和2个细胞系的23,587个细胞的长读长转录组测序。独立使用时，scNanoGPS将容易出错的长读长反卷积为单细胞和单分子，并同时访问单个细胞的表型和基因型。
3. 分析表明，肿瘤和基质/免疫细胞表达不同的亚型（DCI）组合。在肾肿瘤中，鉴定了924个参与细胞类型特异性功能的DCI基因，例如肿瘤细胞中的PDE10A和淋巴细胞中的CCL3。转录组范围的突变分析确定了许多细胞类型特异性突变，包括肿瘤细胞中的VEGFA突变和免疫细胞中的HLA-A突变，突出了不同突变群体在肿瘤中的关键作用。scNanoGPS共同促进了单细胞长读长测序技术的应用。
长读长scRNA序列创建了卵巢癌患者来源组织样本中的异构体目录[4]
案例5 高通量单细胞长读长测序分析人类肿瘤中同一细胞基因型和表型
英文标题：High throughput single cell long-read sequencing analyses of same-cell genotypes and phenotypes in human tumors
发表期刊：Nature Communications
影响因子：14.7，一区
物种样本：4种肿瘤和2种细胞系
测序策略：单细胞全长转录组
DOI：10.1038/s41467-023-39813-7
发表时间：2023.07.11
取样策略
单细胞全长转录组：收集肾细胞癌(RCC)和黑色素瘤(MEL)患者的4个冷冻肿瘤样本，以及A375和H2030两种癌细胞系。
主要研究成果
1. 全长mRNA的单细胞纳米孔测序推动了单细胞多组学研究的发展。然而，该技术面临着测序错误率高和对短读长和/或条形码白名单的依赖等问题。
2. 为了解决这些问题，本研究开发了scNanoGPS来计算同细胞基因型（突变）和表型（基因/亚型表达），而无需短读长或白名单指导。将scNanoGPS应用于来自4个肿瘤和2个细胞系的23,587个细胞的长读长转录组测序。独立使用时，scNanoGPS将容易出错的长读长反卷积为单细胞和单分子，并同时访问单个细胞的表型和基因型。
3. 分析表明，肿瘤和基质/免疫细胞表达不同的亚型（DCI）组合。在肾肿瘤中，鉴定了924个参与细胞类型特异性功能的DCI基因，例如肿瘤细胞中的PDE10A和淋巴细胞中的CCL3。转录组范围的突变分析确定了许多细胞类型特异性突变，包括肿瘤细胞中的VEGFA突变和免疫细胞中的HLA-A突变，突出了不同突变群体在肿瘤中的关键作用。scNanoGPS共同促进了单细胞长读长测序技术的应用。
分析肿瘤微环境中的细胞类型特异性亚型[5]
案例6 慢性淋巴细胞白血病中癌症亚克隆特异性基因型和表型
英文标题：Long-read single-cell RNA sequencing enables the study of cancer subclone-specific genotypes and phenotypes in chronic lymphocytic leukemia
发表期刊：Genome Research
影响因子：6.2，一区
物种样本：慢性淋巴细胞白血病患者血液
测序策略：二代单细胞转录组、单细胞全长转录组
DOI：10.1101/gr.279049.124
发表时间：2025.04.14
取样策略
单细胞全长转录组&二代单细胞转录组：6例慢性淋巴细胞白血病患者血液样本
主要研究结果
1. 布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂通过阻断BTK介导的B细胞存活与增殖信号通路，在慢性淋巴细胞白血病（CLL）治疗中展现出显著疗效，但其耐药性常由特征性BTK C481S突变（阻碍药物结合）引发。
2. 本研究旨在解析携带BTK C481S突变的肿瘤亚克隆群体，并鉴定同时存在其他CLL驱动基因突变的细胞；此外，研究人员还试图明确BTK突变亚克隆是否具有区别于其他肿瘤亚克隆的转录组特征。为实现上述目标，采用scBayes技术整合大样本DNA测序与单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，对单细胞进行亚克隆定义性突变的基因分型。尽管常规scRNA-seq主要依赖短读长测序，但因测序读长多集中于转录本起始端，其转录本覆盖度受到限制。
3. 本研究利用长读长单细胞RNA测序技术，在6名在BTK抑制剂治疗期间获得BTK C481S突变的CLL患者中，显著提升转录本覆盖度，扩大信息突变集，将细胞与癌症亚克隆联系起来。在两名患者体内检测到两种独立演化的BTK突变亚克隆，其绝大多数突变细胞均携带至少一种额外的CLL驱动基因突变。通过解析亚克隆特异性转录特征，发现其中一名患者的BTK突变亚克隆展现出独特的基因表达模式——相较于恶性B细胞群，该亚克隆显著高表达与CLL病理进程相关的基因集，提示其可能存在特异的分子调控机制。
利用细胞分配来识别亚克隆特异性基因表达模式[6]
案例7 患者来源的透明细胞肾癌类器官单细胞中异质性和新型转录表达
英文标题：Heterogeneous and novel transcript expression in single cells of patient-derived clear cell renal cell carcinoma organoids
发表期刊：Genome Research
影响因子：6.2，一区
物种样本：患者来源类器官
测序策略：单细胞全长转录组
DOI：10.1101/gr.279345.124
发布时间：2025.04.14
取样策略
单细胞全长转录组：5例肾透明细胞癌患者来源类器官（1例是正常组织来源类器官，4例是癌组织来源类器官）
主要研究结果
1. RNA剪接失调是癌症的重要分子特征，常导致典型与选择性剪接异构体表达异常。
2. 本研究采用单细胞全长转录组技术，对肾透明细胞癌（ccRCC）患者来源类器官（PDO）细胞进行全长转录本测序。通过对2,599个ccRCC细胞的测序分析，发现细胞间存在显著的剪接异质性失调。经严格过滤后，多数新转录本被剔除，但仍有31,531个转录本（平均占检测总量86,182条的36.6%）为既往未报道的未知转录本。相较于已知转录本，这些新转录本多呈现细胞特异性表达特征。ccRCC细胞共有的新转录本主要来源于缺氧反应、氧化磷酸化等ccRCC相关通路的基因，其中烟酰胺N-甲基转移酶（该基因与ccRCC发生相关）的新型转录本已通过PCR实验验证。
3. 此外，超过50%的新转录本具有完整的预测蛋白编码开放阅读框。在ccRCC与非癌细胞的转录本转换事件分析中，发现多数事件具有细胞与样本特异性，凸显了ccRCC选择性剪接的高度异质性。
4. 本研究系统阐明ccRCC复杂的转录组结构，揭示其侵袭表型的分子基础，为深入解析其分子复杂性提供新见解。
正常和ccRCC-PDOs中的转录景观和细胞异质性[7]
案例8 干细胞样细胞在小儿T细胞急性淋巴细胞白血病化疗耐药和复发中的作用
英文标题：Role of Stem-Like Cells in Chemotherapy Resistance and Relapse in pediatric T Cell Acute Lymphoblastic Leukemia
发表期刊：bioRxiv
物种样本：小鼠血液
测序策略：单细胞全长转录组
DOI：https://doi.org/10.1101/2024.06.24.600391
发布时间：2024.06.28
取样策略
单细胞全长转录组：从小儿T细胞急性淋巴细胞白血病患者P2初次诊断（Ini）和复发（Rel）时采集样本，并植入免疫缺陷小鼠体内，从PDX小鼠中提取T-ALL细胞进行单细胞全长转录组。
主要研究结果
1. T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是一种侵袭性白血病，主要影响青少年和年轻人。T-ALL复发时，常伴有化疗耐药、细胞异质性和预后不佳等问题。
2. 为深入解析复发过程中细胞异质性及其驱动机制，本研究对13对儿科T-ALL患者来源异种移植模型（PDX）样本（包含初诊与复发配对样本）进行了单细胞全长RNA测序，同时纳入5例未复发患者的初诊PDX样本，构建了迄今为止最全面的配对T-ALL纵向单细胞研究数据集。
3. 该研究揭示了个体T-ALL细胞群体间显著的转录组多样性。值得注意的是，18例患者中有11例存在一个具有共同基因调控网络特征的T-ALL细胞亚群，其特征是具有共同的活化调控子、表达模式及剪接异构体。其特征性分子图谱包括干细胞样特征的上调（表现为细胞黏附增强、细胞周期受到抑制及代谢活性降低）以及通过NF-κB表达和TGF-β信号通路介导的耐药性转录程序，同时伴随抗凋亡性T细胞信号的激活。
4. 纵向监测结果显示，这类干细胞样细胞亚群在初诊时仅占白血病细胞中的极小比例，而在复发阶段显著扩增，提示其对一线治疗的固有抵抗性。通过体外及体内药物实验进一步证实了该亚群的化疗耐药性。本研究首次报道了具有内在治疗抵抗性的干细胞样T-ALL细胞群体的存在，为未来开发针对T-ALL干细胞特性通路的治疗策略提供了理论依据。
选择性剪接变体在干细胞样细胞群中显著富集[8]
