027-62435310 | 
service@benagen.com | 
权威综述 | 纳米孔直接RNA测序技术的临床应用：挑战与机遇
近年来，RNA 分子作为潜在的临床生物标志物受到广泛的关注。虽然短读长测序和定量PCR一直是RNA定量分析的主要方法，但这些方法难以捕获关键的转录后调控元件（如RNA修饰），而 RNA 修饰在疾病状态下常常表现失调，与多种疾病的发生发展密切相关。牛津纳米孔技术公司（ONT）开发的直接 RNA 测序（DRS）技术作为一种革命性方法，可以同时捕获 RNA 丰度和修饰信息，并且随着DRS技术的快速迭代以及体液样本中RNA种类失调的证据不断增加，DRS技术在临床应用中的潜力日益凸显。
近日，来自西班牙庞培法布拉大学的Eva Maria Novoa研究团队在《Nucleic Acids Research》期刊上发表了题为“Toward the use of nanopore RNA sequencing technologies in the clinic: challenges and opportunities”的综述，系统探讨了DRS技术临床转化面临的挑战与机遇，重点阐述了其在革新个性化医疗和疾病监测中的广泛应用前景，为DRS在临床诊断和医疗开发提供了理论依据。
英文标题：Toward the use of nanopore RNA sequencing technologies in the clinic: challenges and opportunities
发表期刊：Nucleic Acids Research（IF：16.6）
发表时间：2025.3.24
通讯作者：Eva Maria Novoa（西班牙庞培法布拉大学）
RNA修饰研究与长读长RNA测序技术的发展
过去数十年间，RNA分子始终是生命科学研究的核心对象。尽管mRNA的功能调控研究占据主导地位，但越来越多的证据表明非编码RNA（ncRNA）具有同等重要性。研究表明，ncRNA与mRNA类似，表达丰度在细胞类型、细胞周期、环境应激及疾病状态中均受到动态调控。
除表达水平变化外，RNA分子还可以通过甲基化、异构化、脱氨和乙酰化等表观修饰调控功能发挥（图1）。这些修饰通过影响RNA的稳定性、亚细胞定位及半衰期来影响RNA分子的功能活性。值得注意的是，其中部分修饰（如m⁶A和m⁶Am）可被FTO等去甲基化酶动态逆转。已有大量研究证实，RNA修饰及其与识别、转移、去除相关的酶系在多种癌症和神经系统疾病中普遍失调（图1），使其成为药物研发的新靶点。以上说明RNA修饰不仅可以作为潜在的疾病诊断标志物，还可作为多种疾病治疗的靶点。
图1 RNA修饰及基于DRS的检测技术
纳米孔直接RNA测序原理为：当RNA分子穿过纳米孔时，会引起特征性电流信号变化，这些信号经机器学习算法转化为核苷酸序列和修饰类型。目前RNA修饰检测主要分为三种策略：（i）在测序过程中测量电流信号强度的变化；（ii）识别由于特定位置的 RNA 修饰导致的系统性碱基识别 “错误”；（iii）使用预先训练好的，能够检测特定 RNA 修饰的碱基识别模型（图1）。
早期商业化LB检测主要集中于循环肿瘤 DNA（ctDNA）的突变分析。例如，GRAIL公司的多癌种早期检测技术通过NGS分析cfDNA突变谱已取得初步成果。相比之下，基于RNA的检测虽已有Exai Bio等公司开发的产品（如基于孤儿RNA特征的早期癌症检测技术），但整体研究仍显不足。目前研究多集中于靶向捕获特定的RNA类型，如miRNA、mRNA、长链非编码 RNA（lncRNA）和 tRNA 衍生片段（tRFs）。此外，长读长测序（LRS）通过捕获转座元件和源自重复序列的 RNA（oncRNA），也为癌症诊断提供了新型分子标志物。
值得注意的是，RNA修饰作为疾病标志物的研究尚处起步阶段。现有研究多采用质谱技术，基于测序的方法相对少见。虽然纳米孔直接RNA测序自2017年问世以来已证实其修饰检测能力，但在临床应用方面仍然很少。鉴于RNA修饰与疾病的明确关联，我们亟需解析阻碍DRS临床转化的关键因素。
1. DRS 建库起始量高
限制DRS临床应用的主要障碍之一是其建库所需的RNA起始量较高。ONT DRS 技术所用的SQK-RNA004试剂盒建议起始量为300 ng poly(A)富集RNA或1 μg 总RNA。然而液体活检样本（如血浆）的RNA得率极低，通常9 ml血浆仅能提取约10-35 ng RNA，因此这使得DRS技术在此类样本中难以实施。
突破这一限制的潜在方案是采用混样。通过将多个样本混合进行单次测序，可达到建库最低起始量。例如将100个样本混合上样至单个cell，可获得约1 μg总RNA，满足DRS建库要求。虽然会降低单个样本的测序数据量，但是RNA分子本身的信息丰富性可通过提供更精细的RNA修饰信息来弥补数据损失。目前ONT官方尚未推出商业化DRS建库混样方案，然而，第三方研究已证实其可行性。这些研究表明，DRS建库混样在技术上可行，若进一步开发，可能成为应对液体活检低RNA得率的有效策略。
图3 临床直接RNA测序技术应用：挑战与机遇
2. 短读长捕获效率低
作为长读长测序平台，纳米孔技术通常被认为无法检测低于100-150 nt的RNA分子。但最新研究发现，MinKNOW软件在从原始电流信号数据提取FAST5/POD5 reads时，会将短RNA误判为接头而丢弃。通过手动调整MinKNOW配置参数可使短RNA识别率提升12倍，表明分析软件的参数是短reads丢失的主要原因。值得注意的是，ONT已在最新版MinKNOW（兼容SQK-RNA004试剂盒）中更新默认设置，可实现检测50 nt以上reads。但对于液体活检样本中游离RNA主要为22-45 nt，外泌体RNA约100 nt，仍有待改善。
3. RNA分子5'端少数核苷酸存在丢失
DRS中RNA分子从3'端（3'→5'方向）通过纳米孔时，因建库过程中连接的解旋酶作用，移动速度相对恒定。但5'端最后约15 nt在没有解旋酶辅助的情况下会快速通过纳米孔，导致碱基识别算法无法准确读取这些末端序列。目前已有研究尝试通过接头连接或点击化学反应延伸RNA 5'端，但对于5'端组成未知的液体活检样本，这些方法尚不适用。
4. 测序通量低
与Illumina和PacBio等基于扩增的测序技术不同，DRS直接测序未扩增的天然RNA分子，虽避免了PCR偏倚，但通量大幅降低。这对血浆等低起始样本尤为不利。不过，新版测序试剂通过采用150 nt/s的高速解旋酶（原70 nt/s）和延长纳米孔半衰期，已显示可将通量提升10倍，表现出较大的改进潜力。
5. 参照标准缺失
测序技术临床转化的关键前提是，建立可用于仪器校准、方法验证和结果评估的标准参照。但表观转录组学领域目前缺乏实验室间通用的标准样本和参考数据集，特别是已知序列、丰度和修饰含量的RNA混合物，这类内部校准标准在RNA建库步骤至关重要。虽然ERCC、SIRVs等校准工具已商业化用于RNA-seq，但表观转录组应用尚未有相关解决方案。近期已有curlcakes等体外转录合成标准推出，因需各实验室独立制备，难以保证一致性和可靠性，仍无法满足临床需求。
6. 分析流程开发有限
DRS 技术相对较新，这导致检测 RNA 修饰的新方法频繁涌现。虽然这种快速创新推动了技术进步，但也使针对DRS的系统分析变得复杂，增加了人为错误和结果不一致的风险。为缓解这些挑战，已有开发了诸如 MasterOfPores 和 nf - core 等生物信息学工作流程。然而，由于 RNA 化学技术不断升级，这些工作流程极易过时，无法适用新技术和新方法。
7. 检测稳健性不足
任何临床检测的关键要求是，对同一样本进行重复检测时能够产生一致的结果。然而，对 MinKNOW 软件在大量原始电流强度文件上进行模拟（数据未展示）发现，不同模拟之间的碱基识别reads数量存在差异。这种差异可能导致结果不一致，因为从同一次测序运行中可能会获得不同的reads子集。目前还需要进一步研究，以确定在与最新 RNA 化学技术兼容的最新版 MinKNOW 中，这一问题是否依然存在。
8. RNA化学技术的稳定性尚不明晰
将 DRS 应用于临床的一个关键要求是纳米孔 DRS 化学技术的稳定性。自 2017 年 DRS 问世以来，到目前为止已发布了四个版本的试剂盒（SQK-RNA001至004，其中003未商业化）。虽然每代产品发布都显著提高了纳米孔的半衰期、测序通量和碱基识别准确性，但 DRS 测序芯片和试剂盒的稳定性不足，这是将该技术用于临床的一个主要障碍。需要注意的是，ONT 最近发布了 Q 系列产品，并保证该系列产品至少3年稳定供应，然而，DRS 化学技术尚未被纳入该系列产品中。
DRS的应用潜力：RNA作为疾病标志物
RNA 分子正逐渐被用于早期疾病诊断和预后评估，表明仅 RNA 丰度就足以诊断某些疾病。尽管DRS尚未用于液体活检样本分析，但近年来通过在细胞系、模式生物、血液样本乃至患者组织活检中，应用直接RNA测序，已取得重大进展，尤其在癌症特征发现方面，有力地证明了DRS在样本分类或患者分层方面的潜力。
多种 RNA 类型显示出作为疾病生物标志物的潜力，较为典型的为rRNA、tRNA以及mRNA。
核糖体RNA（rRNA）：作为细胞中含量最丰富的RNA类型，rRNA经过广泛修饰。rRNA动态修饰特征与癌症和先天性角化不良等癌前病变密切相关。DRS研究揭示rRNA修饰模式随组织、发育阶段、细胞类型和疾病状态（包括癌症）显著变化。在肺癌配对样本中，仅凭rRNA修饰谱即可准确区分癌与正常组织，凸显其作为疾病分类标志物的潜力。
转运RNA（tRNA）：tRNA 含量丰富且修饰程度高。除了在蛋白质合成中发挥关键作用外，tRNA 在各种疾病（包括癌症）中的丰度和修饰模式失调现象，以及其对环境刺激的响应，日益受到关注。因此，tRNA 正逐渐成为潜在的诊断和治疗靶点。此外，tRNA 本身也有作为治疗剂的潜力，因其可以促进多个基因共有的基因突变的识别，从而调节突变的影响。传统NGS方法因建库复杂（需去甲基化等预处理）和修饰检测能力有限，难以高效研究tRNA。而DRS通过单次实验同步获取tRNA丰度与修饰信息，可为临床转化开辟新途径。
mRNA：长期以来，mRNA 在 RNA 研究和生物标志物发现领域占据主导地位。除了对 mRNA 的差异表达进行分析外，人们也越来越重视捕获 mRNA 的差异修饰信息，尤其是在癌症研究方面。尽管利用 DRS 研究 mRNA（表观）转录组仍处于起步阶段，但一些开创性研究已经证明了使用 DRS 绘制外周血样本转录组和表观转录组图谱的可行性，展现了临床应用前景。
DRS的未来展望：新机遇
1. SQK - RNA004 化学试剂提升测序通量
ONT在 2023 年发布了 SQK - RNA004 试剂盒（需要配套新的RNA测序芯片），实现了多项重大改进，其中最显著的是测序产量大幅提升，平均提高了 5 至 10 倍。这得益于解旋酶速率从70 nt/s提升至150 nt/s，以及纳米孔半衰期延长。通量提升使得检测低表达水平的 RNA 分子（如长链非编码 RNA）成为可能。
2. 高精度碱基识别新算法开发
新版DRS化学试剂配套的Dorado高精度（HAC）和超精度（SUP）模型使碱基识别准确率>97%（表1）。需注意的是，这种提升并非完全依赖新化学试剂——使用第三方训练的SUP模型时，旧版R9.4/SQK-RNA002化学试剂同样可实现约97%准确率。但这些新算法尚未经过系统验证，未来需评估其在跨物种、RNA类型和样本中的稳定性。
表1 短读长和长读长测序技术的比较及临床应用潜力
3. 新一代修饰碱基识别模型建立
纳米孔DRS的核心优势在于其单分子水平检测天然RNA修饰的潜力。尽管前期研究已证实DRS可识别RNA修饰，但直到最近才真正实现在碱基识别环节从头检测RNA修饰。这些研究表明，经过训练的碱基识别模型不仅能预测四种标准核糖核苷酸（A、C、G、U），还可将第五类非标准核苷酸（如m6A）纳入预测体系。近期ONT进一步优化模型，发布了针对m5C、肌苷（I）和假尿苷（Ψ）等修饰的识别模型，准确率介于92.7%-99.5%。这类模型的显著优势在于仅需单条reads即可完成修饰预测，使得低覆盖度转录本的RNA修饰研究成为可能，极大拓展了潜在生物标志物的范围。但需注意，这些识别修饰模型的准确率与假阳性尚未经过同行评审研究的独立验证，因此相关结论还需审慎解读。
4. DRS 混样策略
目前ONT尚未推出专为DRS设计的商业化barcode试剂盒，barcode混样技术的发展主要还依赖第三方推动，如 DeePlexiCon、WarpDemuX（支持 12 个barcode）和 SeqTagger（最多可容纳 96 个barcode）等工具。在单个cell中实现多达 96 个样本的混样，可能显著降低单个样本的测序成本并减少批次效应，是DRS技术临床转化的重要突破。
5. 实时数据分析工具开发
临床诊断亟需快速经济的疾病监测方案。纳米孔测序凭借实时数据分析能力展现独特优势：例如基于基因组和表观基因组标记，实现了对脑肿瘤的快速分类。整合甲基化组与变异信息的ROBIN框架，将术中肿瘤分类时间从数天缩短至2小时，分析可在24小时内完成；DRS数据实时处理RNA修饰信息已在血细胞测序中验证价值。DRS建库的简易性、设备便携性与实时分析能力，使其在病毒突变监测、流行病防控等领域具有独特应用前景。
总结与展望
全球每年有 2000 万人被诊断出患有癌症，其中约有一半无法得到有效治疗。早期检测和及时干预能够显著改善患者的预后，对公共卫生产生重大影响。因此，迫切需要基于人群的筛查检测方法，以助力早期癌症检测，尤其是针对肺癌、胰腺癌等通常在晚期确诊、预后较差的癌症类型。实施基于人群的癌症筛查计划，能够大幅减轻医疗系统的负担，降低医疗成本，进一步促进社会健康。
虽然RNA修饰研究已开展数十年，但尚未成为常规疾病标志物。现有基于NGS的液体活检技术（检测血浆、外泌体或循环肿瘤细胞中的DNA/cDNA）无法捕获RNA修饰信息。除DRS外，已有定制化NGS与液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）也展现临床潜力，但仍有明显不足：NGS定量精准却依赖酶/抗体反应，且仅适用于有限的修饰类型；LC-MS/MS可广谱检测修饰但缺乏序列背景。
DRS技术能够以快速且经济高效的方式，在保留序列上下游信息的同时，绘制转录组的 RNA 修饰图谱。DRS 在临床应用中具有巨大潜力，尤其是因其能够捕获 RNA 丰度及其修饰信息，而这些特征在疾病中均表现异常。然而，目前一些挑战阻碍了其在临床实践中的应用，包括 RNA 起始量要求高、识别算法模型不足、RNA 化学技术缺乏稳定的生产线以及数据分析复杂等问题。尽管存在这些挑战，但barcode技术、成本降低策略、标准化工作流程、稳定的 RNA 化学产品线和增强的生物信息学工具等解决方案为其发展指明了方向。随着 DRS 技术的不断进步以及各方共同努力应对这些挑战，DRS 有望成为临床诊断中，尤其是液体活检应用中的便捷有效工具。
参考文献：
Xanthi-Lida Katopodi, Oguzhan Begik, Eva Maria Novoa, Toward the use of nanopore RNA sequencing technologies in the clinic: challenges and opportunities, Nucleic Acids Research, Volume 53, Issue 5, 24 March 2025, gkaf128
