英文标题：Demultiplexing and barcode-specific adaptive sampling for nanopore direct RNA sequencing

发表期刊：Nature Communications（IF：14.7）

发表时间：2025.4.21

研究背景

纳米孔直接RNA测序（dRNA-seq）无需RNA反转录为cDNA，可直接解析RNA异构体、Poly(A)尾及碱基修饰，为转录组研究提供独特视角。然而，现有技术缺乏高效多重测序方案，限制了其广泛应用。本研究开发了WarpDemuX技术，即一种基于SQK-RNA002 和 SQK-RNA004 化学试剂，可通过原始电流信号快速解析拆分的barcode混样测序方法。通过使用12个RTA barcode在单张芯片中实现SARS-CoV-2病毒株快速表型分析，揭示了感染过程中亚基因组RNA丰度与Poly(A)尾长动态调控规律。结合自适应采样技术，WarpDemuX成功富集了低丰度病毒RNA，并在SQK-RNA004化学试剂中保持高性能。该技术为dRNA-seq提供了一种经济高效的多重测序解决方案，推动表观转录组学研究迈向新高度。

本研究旨在建立一种稳健、低成本且精准的barcode标记方法，以支持dRNA-seq多重测序及自适应采样实验。本研究将barcode嵌入DNA测序接头（RTA）可定制区域，并直接对原始电信号拆分的策略，从而规避RNA basecalling无法读取DNA接头的技术限制。基于动态时间规整（DTW）算法，构建了适配纳米孔信号特征的机器学习模型，将动态时间规整距离（DTWD）核函数整合至支持向量机（SVM）分类器中，基于DTWD核函数量化未知条形码与已知条形码指纹的相似性，实现reads分类，捕获信号的关键时空信号特征。

图1 WarpDemuX 模型

通过构建双条形码RNA分子（RTA条形码+内嵌RNA条形码）训练SVM-DTWD模型，基于RNA转录本和 RNA 条形码的碱基识别序列为 RTA 条形码建立真实标签（图1a），同时模型训练引入随机分配策略，评估不同RNA序列背景对分类的影响。与DeePlexiCon（DPC）相比，WarpDemuX在4条形码测试中准确率更高（97% vs. 92%），未分类率更低（7.7% vs. 11.4%），且计算速度快10倍（14.4ms/read vs. 163ms/read）。

表1 DeePlexiCon (DPC) 和 WarpDemuX (WDX) 的性能比较

随着感染进程的推进，观察到reads分布存在明显差异（图3b）。病毒RNA在感染后24h首次检出，48h达峰值（占poly-A RNA的50%），72h降至30%（图3c）。同时亚基因组RNA（sgRNA）丰度存在显著差异，其中sgRNA N在感染后48h占比最高（22.3%），sgRNA 10最低（0.25%）。然而各sgRNA的比例在感染周期内保持稳定（图3d），野生株与突变株复制动力学无差异，表明EGFP插入不影响病毒复制。



4. 自适应采样实现条形码平衡与低丰度样本富集

基于纳米孔测序的自适应采样技术，结合WarpDemuX实现实时信号分析，可以突破传统碱基识别方法的延迟瓶颈（图4a）。传统方法因信号批量处理导致决策滞后，影响孔道寿命与测序产量。研究通过修改 MinKNOW 软件，在 RNA 分子的 Poly (A) 尾仍在孔内时做出拒绝决策。在SARS-CoV-2细胞与上清RNA严重失衡的样本中（图4b），该技术使低丰度条形码富集度提升33-73%，基尼系数从0.44降至0.15（图4f）。同时通过实时剔除高丰度样本，孔道周转率提高，单芯片内可以实现样本均衡覆盖，显著提升了低表达病毒RNA检测灵敏度。