中国农业科学院郑州果树研究所鲁振华团队在《Plant Biotechnology Journal》发表最新成果，完成石榴首个端粒到端粒（T2T）无缺口基因组组装。通过多组学整合分析，解析了果皮色泽、籽粒硬度等核心经济性状的遗传调控机制，同时建立基于 CRISPR-Cas9 的基因编辑体系。该研究为石榴分子设计育种提供了基因组学基础，相关成果以 “A telomere-to-telomere gap-free assembly integrating multi-omics uncovers the genetic mechanism of fruit quality and important agronomic trait associations in pomegranate” 为题发表。

主要结论

1. T2T基因组测序、组装与注释

该研究使用37.51 Gb HiFi 数据（~101×）、21.9 Gb ONT 数据（~60×）和37.96 Gb Hi-C 数据（~103×），通过 Hi-C 将 98.53%序列锚定到8条染色体，同时通过染色体核型分析，确认该石榴染色体数目为2n=2x=16，剩余间隙由 ONT （组装）数据填补，最终实现石榴品种‘Moshiliu’的 T2T 无间隙基因组组装。基因组大小366.71 Mb，包括16 个端粒和8 个着丝粒序列，contig N50 达 46.25 Mb，显著优于此前报道的‘Tunisia’基因组（4.49 Mb）。此外，该基因组的完整性通过多重验证，如BUSCO评估完整性达98.64%，二代和 HIFI数据比对率分别为98.01%和99.86%等。注释结果显示，基因组包含32,158 个蛋白编码基因，其中99.18%获功能注释，重复序列占基因组40.61%。

表1 石榴组装和注释特征

2. 石榴非典型端粒重复单元可能影响千屈菜科物种的进化

端粒作为维持基因组完整性的重要结构元件，其重复单元在不同植物类群中通常呈现较高保守性。被子植物普遍具有典型的TTTAGGG端粒重复基序，然而基于石榴T2T基因组结合荧光原位杂交的实验证据，该团队首次在石榴基因组中检测到罕见的TTTTAGGG非典型端粒序列。值得注意的是，此前仅少数藻类和部分微生物被报道具有此类端粒结构，这使得石榴成为目前已知唯一具有此类端粒结构的被子植物代表。深入的系统发育研究揭示，相较于桃金娘目其他物种严格保守的典型端粒特征，千屈菜科植物群体呈现出显著的分化特征—携带TTTTAGGG特殊端粒重复单元，表明非典型端粒基序可能在千屈菜科物种进化中发挥重要作用。基于同义替换率（Ks）和系统发育分析，石榴与千屈菜科（Lythraceae）物种（如Sonneratia alba、Lagerstroemia speciosa）的共同祖先，约在83.78 Mya与野牡丹科（Melastomataceae）、桃金娘科（Myrtaceae）物种分化，且未经历近期全基因组加倍（WGD）事件。

图1 石榴T2T基因组和特殊的端粒基序分析

3. 146 个广泛的石榴品种的变异图谱

基于 146 份石榴种质（142 份新测 + 4 份公共数据）平均测序深度33×的重测序数据，构建了高密度遗传变异图谱，作者推断了146 个石榴品种之间的系统发育关系，这些种质一共被聚类为6 大分支，且遗传结构与地理来源显著相关，中国品种与国际品种存在显著遗传分化。

图2 146 种石榴的系统发育关系和种群结构

4. 基于GWAS鉴定出与15个重要农艺性状相关的16个位点

通过全基因组关联研究（GWAS），在 146 份石榴种质中鉴定出16 个候选位点，覆盖15 个重要农艺性状，包括 10 个果实品质性状（如果皮颜色、籽粒硬度）和 5 个形态性状（如花瓣颜色、茎刺）。其中，两个候选SNP位点（Chr01:87226201和Chr01:84728426）分别与籽粒硬度和白色果皮性状高度关联，其表型变异解释率分别达到100%和86.67%。此外，位于Chr01和Chr05的两个结构变异（SVs）被鉴定为果皮颜色（白色与黑色）的关联区域，对应的表型解释力依次为86.67%和100%。针对其他9个农艺性状的遗传解析中，12个关联位点表现出不同程度的遗传效应。此外，籽粒形态是决定果实品质的重要农艺性状之一。基于三年连续观测的石榴籽粒百粒重表型数据，通过GWAS成功定位到6号染色体3.68-3.88 Mb区间的主效基因座。该区域内共筛选出16个潜在功能基因，其中Pgr06G003620.1等4个基因被鉴定为细胞色素P450 87A3同源基因。功能注释显示，该基因家族成员可作为生长素响应因子调控植物生长发育，且此前在水稻中的功能验证已得到证实。

5. 染色体易位和启动子重复扩增影响果皮颜色特征

果皮色泽是决定果实品质和商业价值核心因素，其形成机制涉及花青素的生物合成和代谢。此前，Ben-Simhon团队（2015）发现石榴PgANS表达缺失引起石榴花青素缺失，但由于基因组结构复杂性及技术局限，他们仅推测可能源于编码区的片段插入（未获实验证实）。本研究通过整合多组学分析手段，首次揭示白皮石榴中37.2 kb染色体易位事件（非插入突变）导致PgANS基因结构破坏，直接造成该基因的转录抑制。为明确该基因功能，研究团队构建了CRISPR-Cas9介导的基因敲除系统，并证实了PgANS在花青素合成中的功能。此外作者还发现，黑皮石榴中PgANR基因启动子区的重复序列扩增通过抑制其表达水平，阻碍花青素向原花青素的代谢转化，最终形成特征性黑色果皮表型。

图3 PgANS染色体易位导致石榴花青素缺失

6. PgNST3基因编码区突变影响石榴籽粒硬度

石榴籽粒硬度是决定口感品质的核心。软籽品种因其可食性高、无残留渣滓而备受市场青睐。研究揭示，内种皮及其次生细胞壁厚度是调控籽粒硬度的关键，遗传学证据表明这一性状可能受单隐性基因座控制。通过全基因组关联研究，该团队成功定位并克隆了籽粒硬度主效位点PgNST3—位于PgNST3编码区166 bp处的非同义SNP（G→A），该突变导致PgNST3蛋白发生E56K突变，与籽粒硬度紧密关联。同时，该基因的表达与籽粒硬度也呈显著相关，该结论通过番茄遗传转化实验得到验证。此外，该团队基于基因表达分析及双荧光素酶实验结果筛选到PgNST3的潜在下游调控转录因子PgMYB46，并发现PgNST3编码区E56K突变影响其与下游转录因子PgMYB46启动子的结合，进而决定籽粒硬度表型的最终形成。

图4 PgNST3调控石榴籽粒硬度

图5 过表达 PgNST3^A 导致番茄种子变软

研究结论

该研究组装了石榴品种‘Moshiliu’的首个端粒到端粒（T2T）无间隙参考基因组，结合多组学分析，鉴定出 16 个与果皮颜色、籽粒硬度等 15 个重要农艺性状相关的遗传位点，揭示了染色体易位、启动子重复扩增、基因突变等对关键表型性状的遗传调控；并建立石榴基于CRISPR-Cas9的基因编辑体系，为石榴分子育种提供了关键资源和理论基础。

参考文献：

Chen L, Wang H, Xu T, et al. A telomere-to-telomere gap-free assembly integrating multi-omics uncovers the genetic mechanism of fruit quality and important agronomic trait associations in pomegranate. Plant Biotechnol J. 2025.