英文标题：Probing enzyme-dependent pseudouridylation using direct RNA sequencing to assess epitranscriptome plasticity in a neuronal cell line

发表期刊：Cell Systems（IF：9.0）

发表时间：2025.4.16

研究背景

目前已发现超过170种RNA修饰，广泛参与RNA代谢、翻译调控、基因表达、剪接及RNA-蛋白质互作等多种生物学过程。其中，假尿苷（ψ）在基因表达调控中发挥重要作用，其在神经元中的动态响应机制尚未完全阐明。

本研究采用纳米孔直接RNA测序（DRS）技术，结合Mod-p ID算法，以神经元细胞SH-SY5Y细胞为模型，探究了mRNA ψ修饰对细胞状态变化的响应机制。通过模拟生理状态下（视黄酸[RA]诱导分化）和病理状态下（铅[Pb²⁺]暴露）两种处理情况，发现ψ修饰呈现出显著的可塑性，即存在响应环境变化的“可塑性位点”和较为稳定的“静态位点”，并且铅暴露导致ψ位点总数增加但整体修饰率降低。研究揭示了假尿苷合成酶TRUB1和PUS7在ψ动态调控中的协同作用，并表明ψ修饰可能在细胞应激中发挥保护功能。该研究为理解神经元表观转录组调控及其在神经疾病中的作用提供了新视角。

主要研究结果

1、RA诱导分化改变细胞状态与ψ修饰图谱

通过RA处理成功诱导SH-SY5Y细胞分化为神经元样细胞，在此过程中，细胞形态发生显著变化，且已知分化标志物基因（如 CRABP2、RET）表达也出现变化（图1A-B, D）。对分化和未处理的 SH-SY5Y 细胞进行DRS测序，并分析PUS酶的表达情况，结果发现分化显著上调了RPUSD3和PUS7L的mRNA水平（图1C），表明ψ修饰合成酶能够响应生理状态的变化。

运用Mod-p ID算法对DRS数据进行分析，在全转录组范围内鉴定ψ位点。在未处理组和分化组中，分别鉴定出 131 个和132 个高修饰位点（U-to-C 错误率> 40%），其中有83个位点保守。例如：变化最显著的基因是ZNF317（参与转录调控和细胞对变化的适应），其修饰率从未处理样本中的 15% 增加到分化细胞中的 52%。其次是THY1（参与神经突生长）基因3'UTR的一个位点ψ修饰率从未处理细胞的34%显著升高至分化细胞的61%。对两种细胞中保守修饰位点进行比较后发现，分化细胞的ψ平均修饰率显著低于未处理细胞（图1E-F），并且大部分（86%）具有显著差异的ψ位点经siRNA敲低（KD）TRUB1/PUS7和多种正交方法（如：BID-seq, PRAISE, RBS-seq, CeU-seq）验证。此外，5个仅由DRS/KD检测到的位点（如DMAC1, EFEMP2, NES, NKAIN1, THY1）通过CLAP凝胶实验成功验证（图1G-H）。

图 1. RA诱导分化对SH-SY5Y细胞mRNA假尿苷修饰及分子机制的影响

2、Pb²⁺暴露诱导独特的ψ修饰变化

使用50 μM Pb²⁺处理SH-SY5Y细胞6天，可以改变细胞状态（图2A-B, D），而DRS分析显示，处理前后13种PUS酶的mRNA表达水平无显著差异（图2C）。分析ψ修饰差异显示，与未处理细胞相比，Pb²⁺处理细胞在保守mRNA靶基因上ψ修饰率平均降低2.72%（图2E-F）。经Pb²⁺处理后，检测到的ψ位点更多，高于分化细胞和未处理细胞（图3F），同时这些新增位点常与氧化应激响应相关（如MRPS14, DHCR7等）。此外，还鉴定出Pb²⁺特异性响应的ψ位点，例如，PHF13（调控染色质结构和DNA损伤响应）基因的一个位点ψ修饰率从未处理库的26%升至Pb²⁺处理库的56%（图2G）。

图 2. Pb²⁺处理对 SH-SY5Y 细胞 mRNA 假尿苷修饰及其机制的影响

3、跨状态比较揭示ψ位点的静态与可塑性分类

综合比较未处理、分化和Pb²⁺处理三种状态，对正交验证的高可信度的ψ位点进行分类，主要分为静态位点（占73%，修饰率在三种状态下保持稳定）和可塑性位点（占27%，响应单种或两种扰动而显著变化）（图3A, G-H）。

静态位点多为TRUB1的靶点，富集在与神经元基本功能（如SLC2A1/GLUT1缺陷综合征相关，UHRF1神经发育障碍相关，EIF4EBP2翻译调控和突触可塑性相关）或管家基因相关通路上。

图 3. 跨三种细胞状态的假尿苷分析实现了全转录组范围可塑性和静态修饰位点的分类

可塑性位点可分为单状态依赖和双状态依赖，前者仅对分化或Pb²⁺暴露有显著响应，例如，NES（巢蛋白，神经元标志物）一个位点在分化后ψ修饰水平降低，但对Pb²⁺无响应（图3A）；而后者对分化和Pb²⁺暴露均有显著响应。其中541个位点在两种扰动下均表现出修饰率下降（图3G）。这些可塑化位点富集于应激响应（如MCM5, FBXO5）、RA信号调控（HECTD1）和核糖体功能（RPL22）相关通路（图3H）。

4、TRUB1与PUS7对ψ动态的协同调控

敲低TRUB1不仅降低其自身靶点（GLUCN motif）的ψ修饰水平，也显著降低了PUS7靶位点（UNUAR motif）的修饰水平（p=0.0003）（图3I）。同时，敲低PUS7可以使得TRUB1 mRNA水平显著降低（p<0.05），而敲低TRUB1也同样显著降低PUS7 mRNA水平。此外，同时敲低TRUB1和PUS7 导致ψ修饰水平降低的位点比例显著增加（图3J）。这些结果表明TRUB1和PUS7在调控mRNA ψ修饰上可能存在协同调节机制。

结论

本研究借助纳米孔直接RNA测序，系统研究了神经元mRNA假尿苷（ψ）修饰的动态可塑性规律，揭示了TRUB1/PUS7协同调控网络，同时深入解析ψ动态修饰的分子机制，为神经表观转录组可塑性提供了直接证据。总之，该研究为理解ψ修饰在神经发育、应激响应和神经毒性中的功能奠定了基础，并为神经发育障碍和神经毒性的诊断与防治提供了新的思路和靶点。

参考文献：

Oleksandra Fanari, Sepideh Tavakoli, Yuchen Qiu,  et al. Probing enzyme-dependent pseudouridylation using direct RNA sequencing to assess epitranscriptome plasticity in a neuronal cell line. Cell Systems. 2025