Direct RNA 测序

一、产品简介

Direct RNA测序：不经反转录、无需扩增，直接读取含有Poly(A)的全长RNA(而不是cDNA)，可以检测单个RNA分子上的m6A、m5C、假尿苷(ψ)和肌苷等修饰位点，能准确分析可变剪接、融合基因和鉴定新异构体;此外,还可对Poly(A)尾长度进行相对准确的估算，还原真实的RNA特征。

二、Direct RNA测序优势

1. 单碱基水平RNA 修饰(m5C、m6A、假尿苷ψ和肌苷等)

2. 单分子read的Poly(A)长度

3. 准确度提升(reads质量中位值达Q21，m6A的识别准确率97.1%，假尿苷ψ(97.6%)，m5c(85.37%)和肌苷Ⅰ(93.8%))

三、特色分析内容

1. m6A修饰与转录本表达关联分析

2. 可变剪切与RNA修饰关联分析

3. Poly(A)长度与Poly(A)位点及转录本表达的关联分析

四、近期发表Direct RNA测序高分文献列表

Q：Direct RNA测序推荐送样量？

Direct RNA测序默认送组织样本：动物组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm ，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小，送样量须达到至少0.3g（不同组织类型，送样量要求不一样，请与当地销售具体沟通），DRS细胞总量≥5 X 107个起送，血液样品：哺乳动物全血，10-15ml 及以上；鱼类、禽类、两栖类全血，1-2ml 及以上；植物DRS送样量须达到至少2g。

Total RNA的送样要求：

Q：Direct RNA测序目前可以鉴定哪些RNA修饰？准确度是怎样的？

下方是ONT官方提供的各种RNA修饰鉴定的准确度：

Q：修饰差异转录本和含有修饰的差异表达转录本之间有什么区别？

修饰差异转录本是比较组间转录本的修饰也就是Fraction的值有差异的转录本，含有修饰的差异表达转录本是将含有修饰的reads筛选出来在进行差异表达分析，鉴定到的转录本。

Q：Direct RNA测序需要二代数据校正吗？

目前Direct RNA测序采用的是新试剂盒RNA004试剂盒，RNA004试剂盒在测序速度、产量、basecall准确度、甲基化检测准确度上都有质的提升，准确度提升至99%以上，因此不需要二代转录组进行校正。

Q：病毒DRS测序，需要注意哪些事项？

1、病毒RNA是单链还是双链；目前只能做单链RNA

2、病毒RNA是否有PolyA结构以及PolyA结构大概的长度分布；

3、病毒RNA序列的长度分布范围（10k以内）。过长的片段被完全测通的风险会增加，由于反转录以及扩增存在一定的效率问题，一般对于10knt以上长度的RNA需要谨慎，反转录和扩增的难度急剧增加；RNA中如果存在不同长度范围的片段，会存在短片段偏好，长片段被测通的风险进一步增加。

案例一

使用Nanopore Direct RNA测序构建人源化肝脏的表观遗传学图谱(Journal of Hepatology,lF=25.7)

1. 基于人源化肝脏的Direct RNA测序数据分析，构建了人和小鼠肝脏转录组的从头注释。与人GENCODE v33数据库和小鼠GENCODEvM24数据库相比，分别鉴定到54.6%和70.8%的新转录本。基因间区中鉴定了212个新基因，并对其中一些基因进行了序列验证和功能验证。

2. m6A修饰位点分析发现有超过三分之一含有GGACA motif，其中超过40%具有转录本或基因表达水平的变化，表明RNA上的m6A修饰可以调控其表达水平。

3. Poly(A)尾长度分析显示Poly(A)尾长在转录本上的分布因基因而异。

参考文献：

Jiang C, et al. Comprehensive gene profiling of the metabolic landscape of humanized livers in mice. Journal of Hepatology 2023

案例二

项目案例：直接RNA测序揭示苹果抗链格孢菌病的分子机理(Developmental Cell, IF=10.7)

山梨醇是苹果中主要的光合产物和运输碳水化合物在调控苹果对链格孢菌的抗性中作为信号分子，通过调控R基因NLR16的表达发挥作用。然而，山梨醇如何介导这一抗性机制尚不明确。本研究通过直接RNA测序技术，揭示了山梨醇通过m6A 修饰调控苹果抗性的分子机制。

通过LC-MS/MS和直接RNA测序(DRS)结果均表明，山梨醇合成的减少导致苹果叶片中m6A修饰水平显著降低。DRS结果显示A10中m6A修饰位点显著减少，尤其是在CDS和3'UTR区。

A10中有12,010个差异m6A甲基化位点，超甲基化转录本表达水平较高，而低甲基化转录本表达水平较低表明m6A修饰与转录本丰度呈正相关。进一步研究发现，山梨醇通过调控甲基转移酶基因MdVIR1和MdVIR2的表达影响m6A修饰水平。功能实验证实，山梨醇通过MdVIR1/2调控的m6A修饰，稳定了MdWRKY79和MdNLR16的mRNA，提高其翻译效率，从而维持足够的MdNLR16蛋白水平，以识别链格孢菌的效应蛋白，触发免疫反应。

本研究揭示了山梨醇通过调控m6A RNA修饰介导苹果对链格孢菌抗性的分子机制，为植物抗病研究提供了新见解。

参考文献：Zhihua S, et al. Nanopore RNA direct sequencing identifies that m6A modification is essential for sorbitol-controlled resistance to Alternaria alternata in apple. Developmental Cell, 2025

利用 gffcompare，将非冗余转录本与基因组的已知转录本进行比较，发现新的转录本和新基因，对现有注释进行补充。使用七个数据库进行转录本功能注释，包括：Nr、Pfam、Uniprot、KEGG、GO、KOG/COG、PATHWAY。

样品中新转录本类型的数量分布图

对基因包含转录本的数目进行统计，基因包含转录本数目大于8个，统一记为一类，从已知和所有两个方面进行统计绘图。

包含不同数目转录本的基因数目图

基因转录生成的前体 mRNA（pre-mRNA），有多种剪接方式，选择不同的外显子，产生不同的成熟 mRNA，从而翻译为不同的蛋白质，构成生物性状的多样性。这种转录后的 mRNA 加工过程称为可变剪接或选择性剪接（Alternative splicing）。通过 suppa2软件获取每个样品存在的可变剪接类型，对转录本发生可变剪接事件情况进行统计。

可变剪接类型分布图

大多数真核 mRNA 的 3‘非翻译区域下游含有一个非模板化的 poly(A)尾，这个尾有助于 mRNA 的稳定和向细胞质内的运输。poly(A)尾长度会影响mRNA的翻译效率，因此，poly(A) 尾长度分析可解析 mRNA 降解和翻译的动态调控过程，也能够发现一些 RNA 裂解和加尾的未知特点。使用 Dorado对有效数据的 poly(A) 长度进行计算，获得转录本对应的 poly(A) 长度。

不同样本的 poly(A) 尾长的分布图

将 poly(A) 长度中位数与表达量关联起来，得到 poly(A) 长度与转录本表达量的关联结果。

样品 poly(A) 长度与表达量的分布图

甲基化在核酸和蛋白质中是一种非常重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。RNA 甲基化是在甲基转移酶的催化作用下，在RNA 分子的某一个原子上添加一个甲基基团（CH3），主要包括 m5C RNA 甲基化、m6A RNA 甲基化、m7G RNA 甲基化等。目前最热门的是 m6A RNA 甲基化，即 RNA 分子腺嘌呤第 6 位氮原子上的甲基化修饰（N6-methyladenosine，m6A），是真核生物 mRNA 最常见的一种转录后修饰。

使用Dorado的最新模型，可以同时鉴定 m6A、m5c、假尿苷psu、肌苷、2-O甲基化等修饰位点。以下结果展示均以 m6A 为例，m6A 位点鉴定结果如下：

样品 m6A 位点周围 5bp 序列分布图

基因结构的 m6A 位点分布

使用 modkit软件进行差异甲基化位点分析和差异转录本分析。筛选含有 m6A 修饰差异的表达转录本进行功能富集分析。

m6A修饰差异的转录本 PATHWAY 富集分析 dotplot 图

m6A修饰差异的转录本 GO 富集分析 barplot 图