哺乳动物性腺性别决定依赖于关键转录因子（如Sry/Sox9）和信号通路的精确平衡，但驱动这一过程的非编码调控元件（如增强子）及其动态变化尚不清楚，如约50-70%的人类性发育差异（DSD）病例无法通过外显子测序诊断，暗示非编码区变异的重要作用。先前研究缺乏对性别决定关键时期（如小鼠胚胎期E11.5-E12.5）的高分辨率多组学分析，阻碍了对基因调控网络的全面解析。

2025 年 7 月 25 日，Nitzan Gonen 团队于《Science Advances》期刊发表题为《The gene regulatory landscape driving mouse gonadal supporting cell differentiation》的研究成果。该研究构建了 Enh8-mCherry 转基因小鼠新模型，结合多组学分析手段，绘制出发育阶段中染色质可及性与转录组的动态变化图谱。在此基础上，团队提出 “雌性决定延迟” 模型—— 即睾丸支持细胞的分化进程早于前颗粒细胞，并发现 EMX2、LHX9 等非经典卵巢决定因子，为性别决定机制的相关研究提供了新视角。

实验设计及技术路线：

1、细胞分选：构建新型 Enh8-mCherry 转基因小鼠品系（标记雌性前颗粒细胞），结合已有的 Sox9IRES-GFP小鼠品系（标记雄性支持细胞），通过荧光激活细胞分选（FACS），在E11.5、E12.5、E13.5和E15.5四个关键阶段，分别纯化前颗粒细胞和睾丸支持细胞。

2、多组学数据采集：对分选细胞进行转录组测序（RNA-seq），获取基因表达动态数据；同时进行染色质可及性测序（ATAC-seq），鉴定开放染色质区域（潜在顺式调控元件）。

3、调控元件与靶基因关联分析：通过关联分析，将开放染色质区域与邻近基因的表达模式关联，预测潜在增强子和沉默子；利用启动子捕获 Hi-C（PCHi-C）实验，在 E13.5 阶段验证调控元件与靶基因的物理相互作用。

4、转录因子调控分析：对性别二态性开放染色质区域进行转录因子结合基序富集分析，并通过 ATAC 足迹分析，鉴定实际结合的转录因子及其动态结合模式

5、数据整合与验证：整合转录组、染色质可及性及调控相互作用数据，构建基因调控网络。

图 用于多组学分析的前颗粒细胞分选富集型新小鼠品系的构建

主要研究结论

1、ATAC-seq 揭示性别二态性染色质可及性动态变化

通过 ATAC-seq 对E11.5、E12.5、E13.5和E15.5四个关键阶段的性腺支持细胞（睾丸支持细胞、雌性前颗粒细胞）进行分析，共鉴定出 87,988 个高置信度开放染色质区域（覆盖小鼠基因组的 2.8%）。这些区域的可及性随发育呈现显著性别差异：雄性支持细胞从 E11.5 起即出现大量性别特异性开放区域（12,679 个），且随发育持续增加（E15.5 达 24,703 个）；雌性前颗粒细胞的性别特异性开放区域启动较晚，从 E12.5 开始显著增加（7476 个），E15.5 增至 16,619 个。这一动态差异提示雄性性腺分化的染色质调控启动早于雌性，与支持细胞分化命运的性别特异性时间差一致。

图 支持细胞分化过程中性二态性开放染色质区域的建立

图 支持细胞分化过程中开放染色质区域的动态变化

2、RNA-seq 解析支持细胞分化的性别特异性表达谱

RNA-seq 数据显示，随发育进程，性别差异表达基因数量从 E11.5 的约 1500 个增至 E15.5 的 3600 余个，形成清晰的 “雄性分化” 与 “雌性分化” 转录组特征；且睾丸支持细胞富集有丝分裂与上皮形态发生基因（Cdk1，Sox9），雌性前颗粒细胞富集WNT通路（Wnt4, Rspo1）与上皮形态发生（Bmp2）。此外，整合 RNA-seq 与 ATAC-seq 数据发现，染色质开放区域的可及性变化与邻近基因表达呈显著相关性。

图 支持细胞分化过程中的转录组特征分析

3、PCHi-C 验证调控元件与靶基因的物理互作网络

通过分析基因表达与染色质可及性的相关性，识别出 44,116 个潜在调控区域，其可及性与 10,685 个基因相关，正相关区域推测为增强子、负相关为沉默子，并以 Sry、Lef1、Fgf9 等基因为例展示了具体关联；同时，通过对 E13.5 阶段纯化细胞进行 PCHi-C 实验，检测到雌性前颗粒细胞 82,532 个、雄性支持细胞 108,206 个启动子与调控元件的物理互作（60,909 个为两性共有），这些互作区域富集活性增强子和转录标记，且高表达基因常关联更多调控区域，还验证了 Foxl2 下游雌性特异性区域与 Foxl2 启动子、雄性特异性区域与 Serpine2 基因等关联，为调控元件与靶基因的作用提供了证据。

图 基因-顺式调控区域关联预测

4、转录因子与调控元件的协同作用

通过 ATAC 足迹分析，在性别二态性开放染色质区域中鉴定出前颗粒细胞和支持细胞中与调控元件结合的不同转录因子（TF）。结果显示，性别二态性富集的转录因子结合基序多数存在差异结合，其中前颗粒细胞中 EMX2、LHX9 等因子的结合基序差异结合最显著，结合其在该细胞中的表达特征，提示二者可能在卵巢分化中起关键作用；睾丸支持细胞中 DMRT1 和 SOX 家族因子的结合基序差异结合最显著，印证了它们在支持细胞分化和维持中的核心地位。进一步对特定基因位点的足迹分析，明确了不同性别调控元件上具体结合的转录因子，揭示了性特异性转录因子通过结合调控元件调控基因表达的机制。

图 性别二态性开放染色质区域的 ATAC 转录因子足迹

研究小结

该研究借助 ATAC-seq、RNA-seq 及 PCHi-C 等多组学技术，以小鼠性腺支持细胞为对象，在 E11.5 至 E15.5 关键阶段分选细胞并分析。通过解析染色质开放区域与基因表达的关联，定位性别特异性调控元件，发现支持细胞分化存在性别特异性调控模式，且非编码区调控元件变异可能是性别发育差异的关键原因，为理解性别发育机制及相关差异的遗传基础提供了重要依据。

参考文献：

Stévant, Isabelle et al. “The gene regulatory landscape driving mouse gonadal supporting cell differentiation.” Science advances vol. 11,30 (2025): eadv1885. doi:10.1126/sciadv.adv1885