不结球白菜（Non-heading Chinese cabbage，NHCC，涵盖小白菜、菜心等常见品种），是一种重要的蔬菜作物，在亚洲地区广泛种植。叶片衰老速率是影响其产量和品质的关键性状。但目前关于不结球白菜叶片衰老的分子机制缺乏深入研究。

近日，上海农业科学院与复旦大学联合团队在《Advanced Science》（影响因子14.1）发表题为“An Antagonism Between Ethylene Signaling and DNA Methylation Orchestrates the Progression of Leaf Senescence in Non-heading Chinese Cabbage”的研究论文，首次系统揭示了乙烯信号通路关键因子EIN3A与DNA甲基转移酶CMT2协同调控白菜叶片衰老的分子机制，为解决“黄叶难题”提供了全新的理论依据与技术靶点。

EIN3A与CMT2的“调控博弈”决定叶片衰老进程

主要结果

1、不结球白菜叶片衰老的生理与转录组分析

研究团队在自然生长条件下观察了不结球白菜叶片表型并将其划分为三个不同阶段：上部叶片仍处于非衰老阶段（NS，无可见黄化迹象）；中部叶片进入早期衰老阶段（ES，叶绿素降解 30%-40%）；下部叶片则分别进入晚期衰老阶段（LS，叶绿素降解 > 70%）。对叶绿素含量、PSII（光系统 II）最大光化学效率（Fv/Fm）、离子渗漏率以及衰老相关标记基因 SAG12 表达量的检测，进一步证实了叶片衰老呈梯度递进趋势。

图1-1 不结球白菜的表型及叶绿素成像分析

研究团队对叶片 NS、ES、LS三个阶段进行RNA-seq分析，PCA显示不同阶段样本分离明显，说明衰老过程中转录组差异显著。与NS相比，ES有2913个DEGs（1291个上调、1622个下调），LS的DEGs更多（2794个上调、3377个下调）。维恩图显示，ES和LS与NS相比，共上调980个基因、共下调1404个基因，20个基因表达趋势相反。对两组比较合并的6680个DEGs绘制热图，结果揭示了叶片衰老时基因表达的不同动态模式。

图1-2 不结球白菜的转录组分析

2、不结球白菜衰老相关信号通路的鉴定

研究团队通过聚类分析，将6680个衰老相关DEGs分为4类基因簇，基因簇1和2基因表达总体上升：基因簇1在ES阶段快速升高为高表达并维持，基因簇2在ES阶段小幅上升、LS阶段显著上升；基因簇3和4基因表达随叶片衰老下降：基因簇3在ES阶段快速下调，基因簇4在整个衰老过程中逐渐下调。

图2-1 不结球白菜6680个与叶片衰老相关的DEGs的聚类分析

GO富集分析结果显示，基因簇1主要关联水杨酸（SA）信号传导及免疫反应，其次为叶片和植物器官衰老、乙烯（ET）激活的信号传导。基因簇2除关联叶片和器官衰老通路外，在响应营养水平、饥饿及氮水平的通路中也高度富集，暗示叶片衰老后期存在活跃的营养再分配。基因簇3富集的通路主要与光合作用及硫代葡萄糖苷或糖苷代谢过程相关。基因簇4中富集程度最高的为伤口防御和病原体防御相关通路。

图2-2 不结球白菜与衰老相关的DEGs的GO富集分析

综上，叶片衰老早期SA和ET信号激活且光合作用下降，随着衰老推进，叶绿体等细胞器降解，大分子物质分解代谢并启动营养再分配，衰老后期防御基因下调可能使叶片更易受病原体侵袭。

3、EIN3A和CMT2在不结球白菜叶片衰老过程中的差异表达

已有研究表明，SA和ET分别通过依赖EIN3和NPR1（植物激素基因）的方式调控叶片衰老。不结球白菜基因组编码3个EIN3基因和3个NPR1基因。qPCR 结果显示，仅EIN3A在叶片衰老过程中显著上调，表明其在调控叶片衰老方面可能与拟南芥EIN3具有功能相似性。

图3-1 不结球白菜叶片衰老过程中植物激素相关基因的表达模式

基因转录受反式作用调控因子和顺式作用表观遗传状态（包括DNA甲基化和组蛋白修饰）的共同调控。研究团队重点分析了编码DNA甲基转移酶和去甲基化酶的基因表达模式。不结球白菜基因组包含9个DNA甲基转移酶基因和4个DNA去甲基化酶基因。除CMT2外，所有检测基因在叶片衰老过程中均未表现出显著变化，而CMT2在衰老早期和后期均显著下调，这表明CMT2介导的DNA甲基化可能参与调控不结球白菜的叶片衰老过程。

图3-2 不结球白菜叶片衰老过程中DNA甲基化相关基因的表达模式

4、EIN3A直接抑制CMT2的表达，从而下调叶片衰老过程中的甲基化水平

研究团队检测了ET和EIN3A对CMT2表达的影响，发现经ET处理3天后，EIN3A表达显著上调，而CMT2表达显著降低。为验证EIN3A是否直接调控CMT2，研究开展了双荧光素酶实验，实验纳入了两个ORE1同源基因（拟南芥中已知的EIN3靶基因），结果显示EIN3A瞬时过表达可激活两个ORE1同源基因的启动子，但会强烈抑制CMT2的启动子。

研究团队对CMT2启动子进行基序筛选，在4个不同区域鉴定出6个潜在的EIN3结合位点。ChIP-qPCR分析表明，EIN3A在P2、P3和P4区域显著富集（含3个串联EBS的P3区域结合能力最强），而在远端的P1区域无富集。进一步通过EMSA实验体外验证，发现EIN3A-MBP与P3a或P3b探针共孵育可产生迁移条带，过量添加未标记竞争寡核苷酸则消除该条带，表明ET通过EIN3A直接抑制CMT2启动子活性使其表达下调。

此外，研究团队采用VIGS技术靶向沉默CMT2或EIN3A并结合WGBS测序，发现CMT2沉默会显著降低CHH背景的DNA甲基化水平（对CG、CHG 背景无显著影响），EIN3A沉默对全基因组DNA甲基化几乎无影响。进一步分析显示，CMT2沉默植株中其基因本体及其侧翼区域的CHH甲基化水平均降低。与此一致，差异甲基化分析结果也显示CMT2沉默植株中低甲基化区域和基因数量比高甲基化多。启动子甲基化水平分析也进一步证实CMT2主要参与CHH甲基化过程。

图4 不结球白菜叶片衰老过程中植物激素与DNA甲基化相关基因的表达模式

5、不结球白菜DNA甲基化降低叶片衰老速度

研究团队对NS（未衰老）、ES（衰老早期）、LS（衰老后期）叶片样本进行WGBS测序，发现叶片衰老过程中全基因组DNA甲基化水平逐渐下降；与NS相比，ES和LS的低甲基化区域数量显著多于高甲基化区域，且这些差异甲基化区域主要分布在基因间区、启动子区域，其次是内含子和外显子。ES检测到984个低甲基化基因、415个高甲基化基因，LS则有5910个低甲基化基因、388个高甲基化基因。虽然基因组CG甲基化丰度最高，但启动子区域的差异甲基化基因主要在CHG和CHH背景下，且三种甲基化程度均随着衰老下降，其中转录起始位点上游1kb区域和转录终止位点下游区域下降最显著。

研究团队为探究DNA去甲基化与乙烯诱导叶片衰老的关联，用DNA甲基化抑制剂（5-氮杂胞苷，5-Aza）和乙烯处理离体不结球白菜叶片，5天后监测衰老特征。结果显示，5-Aza与乙烯类似可促进叶片衰老，且二者联合处理的衰老症状比单独处理更严重，由此推测在不结球白菜中，DNA 甲基化可能对ET诱导及年龄触发的叶片衰老起 “抑制” 作用。

图5 DNA甲基化抑制不结球白菜叶片的衰老过程

6、不结球白菜中CMT2与EIN3A介导乙烯及年龄触发的叶片衰老过程

研究团队用VIGS系统在不结球白菜中沉默CMT2和EIN3A，对相关植株离体叶片进行5-Aza和ET处理，结果显示：与对照相比，CMT2沉默轻微加速5-Aza诱导的衰老、显著促进ET触发的衰老，EIN3A沉默显著但未完全减弱ET触发的衰老，二者共沉默植株呈中等衰老表型（未完全抑制或因EIN3A残留活性、EIN3B等功能冗余），说明DNA甲基化降低加速ET诱导的衰老，且至少部分依赖 EIN3A。研究团队后续在不结球白菜品种“菜心”中研究发现， EIN3A沉默时CMT2表达上调；自然生长下，CMT2沉默加速年龄触发的衰老，EIN3A沉默延缓衰老，表明二者在不结球白菜中以拮抗方式调控ET及年龄触发的叶片衰老。

图6 CMT2和EIN3A调控不结球白菜植株叶片衰老

7、CMT2介导的DNA甲基化抑制EIN3A介导的衰老相关基因（SAG）的表达

研究团队为探究 DNA 甲基化下降与SAG表达的关系，分析了低甲基化基因、上调差异表达基因与已注释SAG的关联，韦恩图显示衰老叶片中有108个SAG同时呈显著上调和低甲基化的特征。对这108个基因分析发现，叶片衰老时其CG、CHG、CHH三种甲基化水平均降低；进一步筛选出9个与EIN3A 表达趋势相似的SAGs，且它们的启动子CHH 甲基化水平均有不同程度下降。

研究团队推测这些SAGs中部分是EIN3A的靶基因，且其启动子区域的甲基化会阻碍EIN3A的结合。研究团队检测了EIN3A和CMT2对这9个SAGs启动子活性的影响，结果显示EIN3A过表达能激活9个SAG中6个的启动子（NAC55、ProDH2最显著），而单独CMT2对这些启动子无明显影响，但 CMT2过表达会拮抗EIN3A对启动子的激活作用。后续研究团队通过ChIP-qPCR检测探究DNA甲基化是否影响EIN3A介导的SAG表达。结果发现体内环境中EIN3A可结合ProDH2、NAC55启动子的EBS位点，5-Aza处理后EIN3A在多数EBS片段上的结合丰度提高。

综上，SAG启动子区域的DNA甲基化可能干扰 EIN3A 结合，进而抑制叶片衰老中这些基因的诱导表达。

图7 EIN3A和CMT2相互拮抗调控 SAGs 的表达

小结

该研究既揭示了新的分子机制，也为农业生产提供了切实可行的解决方案，一方面其突破了此前DNA甲基化与衰老的研究多集中于拟南芥或水果的局限，首次在不结球白菜中揭示出依赖DNA甲基转移酶CMT2而非去甲基化酶的独特衰老调控机制，为其他作物相关研究提供了参考，拓展了植物衰老研究范畴；另一方面通过调控EIN3A或CMT2的表达，有望培育出叶片衰老慢、货架期长的不结球白菜品种，且未来或可借助抑制EIN3A活性、适度提高甲基化水平等化学调控方式，在蔬菜采摘后延缓衰老，减少运输与储存环节的损失，实现保鲜期的精准调控。

参考文献：

Zhang D, Luo Y, Wang H, et al. An Antagonism Between Ethylene Signaling and DNA Methylation Orchestrates the Progression of Leaf Senescence in Non-heading Chinese Cabbage[J]. Advanced Science, 2025: e14954.