N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最常见的内源性化学修饰，在mRNA代谢的多个阶段发挥关键调控作用。近年来，随着基于m6A特异性抗体的RNA免疫沉淀测序（m6A RIP-seq）技术的发展，m6A修饰在多种病毒RNA中被广泛报道，包括在细胞核或细胞质中复制的病毒。然而，由于m6A甲基转移酶复合物主要定位于细胞核，细胞质中病毒RNA如何获得m6A修饰及如何调控尚未明晰。

近日，北京市农林科学院李少芳团队与中国农业科学院/浙江大学周雪平团队联合在Science Bulletin期刊（IF2025 = 21.1）在线发表题为Epi-transcriptome analysis reveals the lack of N6-methyladenosine modification in two RNA viruses infecting watermelon的研究论文。该研究综合利用纳米孔直接RNA测序等多种m6A检测技术，系统分析和验证了细胞质病毒RNA的m6A修饰特征，揭示了侵染西瓜的两种细胞质复制型RNA病毒——瓜蒌斑驳花叶病毒（trichosanthes mottle mosaic virus, TrMMV）与西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus, ZYMV）RNA中缺乏N6-甲基腺苷（m6A）修饰，为植物病毒表观转录组学研究提供了新见解。

贝纳基因参与了该项目Direct RNA测序工作。

本研究以两种侵染西瓜的细胞质RNA病毒西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）和栝楼斑驳花叶病毒（TrMMV）为研究对象（图1a），其中TrMMV基因组包含一条基因组RNA（gRNA）和两条亚基因组RNA（sgRNA），其5'端为m7GpppG帽结构，3'端为tRNA样结构（TLS）。ZYMV基因组为单链正义RNA，5'端为VPg蛋白，3'端为poly-A尾。研究首先通过体外转录RNA（IVT RNA）作为阴性对照，结合液相色谱-质谱验证其无m6A背景信号（图1b），随后进行m6A RIP-seq检测分析发现，尽管病毒RNA与IVT RNA均显示reads在3'端出现m6A富集，但是通过exomePeak2软件严格统计分析发现，TrMMV RNA中完全未检测到可信的m6A peak，而ZYMV RNA中观察到的15个低富集 peak（约2倍）与IVT RNA中的背景信号相当，远低于内源性m6A peak的富集水平，表明这些信号均为实验假阳性（图1c~d）。

为进一步验证这一发现，研究采用不依赖于抗体的单碱基分辨率GLORI-seq技术进行分析，结果显示病毒RNA中所有腺苷位点的m6A修饰水平均低于10%的检测阈值，而阳性对照中已知m6A位点的修饰水平高达98%，从化学修饰层面确证了两种病毒RNA缺乏m6A修饰（图1e~g）。纳米孔直接RNA测序（DRS）的结果同样支持这一结论：即使在最宽松的P值阈值（0.1）下，ZYMV RNA中检测到的少量m6A信号与IVT RNA对照相比也无显著差异，并且同时未检测到其他表观修饰（如m5C、Ψ和A-to-I编辑）的存在（图1h）。

图1：细胞质RNA病毒ZYMV和TrMMV的m6A修饰

本研究通过三种互补的m6A检测方法，全面分析了两种典型细胞质RNA病毒（TrMMV和ZYMV）的m6A修饰情况，明确揭示了其RNA基因组中缺乏m6A修饰。这一发现不仅与m6A甲基转移酶复合物定位于细胞核的特性一致，支持了仅核内复制的病毒可能具有m6A修饰的观点，为理解病毒RNA表观转录组调控提供了重要线索；同时还强调了在m6A检测中使用阴性对照的重要性和必要性，为今后病毒表观转录组学研究提供了方法学参考。

李少芳团队以高通量测序文库构建、生物信息学分析和大量优质的种质资源为依托，研究西瓜重要育种性状的分子调控和表观修饰调控机制。实验室常年招聘分子生物学和生物信息学专业的博士后和科研助理，有高通量文库构建经验者优先，欢迎各位有志青年应聘（lishaofang@nercv.org）。

参考文献：

Pan F, Jing J, Qiu Y, et al. Epi-transcriptome analysis reveals the lack of N6-methyladenosine modifications in two RNA viruses infecting watermelon[J]. Science Bulletin, 2025: S2095-9273 (25) 00739-X.