文章标题：Isoform-level profiling of m6A epitranscriptomic signatures in human brain

发表期刊：Science Advances

发表时间：2025年8月

影响因子：12.5

研究介绍

RNA修饰N6-甲基腺苷（m6A）在人类大脑中高度富集，与多种神经疾病密切相关。然而，传统m6A检测方法（如免疫沉淀结合短读长测序）受限于基因水平分辨率，无法揭示RNA特异的修饰模式。

本研究应用牛津纳米孔直接RNA测序（DRS）技术，对人类大脑的前额叶皮质PFC、尾状核CN和小脑CB三个脑区进行检测，绘制了大脑转录组中异构体水平的 m6A 修饰图谱，并结合不同脑区的异构体表达和 Poly(A) 尾长进行分析，为大脑区域特异性研究以及相关疾病和发育机制提供了新的见解。

图1 人脑样本的 DRS 实验流程概览

主要研究结果

1. 脑区特异的转录组与表观转录组差异

对10例无神经系统疾病的死后人类大脑样本的前额叶皮层（PFC）、尾状核（CN）和小脑（CB）进行DRS测序，获得>5200万条高质量reads（中位长度720 nt），鉴定出>22000个基因和>62000个异构体。主成分分析显示，CB的基因和异构体表达模式与PFC、CN明显不同（图2A-B）；同时差异表达分析鉴定出9,908个差异表达基因（DEGs）和16,390个差异表达异构体（DEIs）（图2D），其中CB中特异性上调的DEIs占比最高。

图2 脑区存在广泛的基因与异构体表达差异

表1 在每个脑区中表达或使用显著上调的基因和异构体

值得注意的是，764个异构体存在差异使用（DIU），涉及到317个基因。其中，DIU基因在脑区之间存在异构体转换现象：例如PRMT7（精氨酸甲基转移酶）在CN中主要表达无义介导降解（NMD）异构体，而PFC和CB则以表达全长蛋白编码异构体为主（图3A）；WTAP（m6A甲基化转移酶）在CB表达含完整结构域的长异构体，而PFC/CN偏好表达缺失关键外显子的短异构体，推测后者m6A甲基化转移酶活性降低（图3B）。

图3 临床相关基因在脑区之间呈现异构体使用差异

2. 异构体水平m6A图谱的系统绘制

借助DRS能够在异构体水平识别 m6A 修饰位点的优势，研究首次在单碱基分辨率下绘制人脑m6A修饰图谱。结果显示，m6A位点富集于mRNA终止密码子附近及3'UTR区，与经典研究一致（图4A），整体中位修饰率为0.66。65%的基因（7,389个）和55%的异构体含有m6A位点（图4B），其中小脑（CB）的修饰基因比例（63%）、修饰异构体比例（54%）及位点修饰率（中位值：0.71）均高于PFC和CN（图4B-C），这与CB中多个m6A甲基化转移酶和甲基化识别蛋白基因表达上调一致。进一步分析发现，CB 中长异构体的上调可能部分导致m6A 修饰水平升高，而CN中去甲基化酶FTO的表达升高可能降低了局部修饰水平（图4E）。

图4. 三个脑区异构体水平的m6A修饰位点特征

3. 未注释m6A位点的脑区特异性分布

通过对比RNA修饰相关的公共数据库（m6A-Atlas和DirectRMDB），发现鉴定得到71.36%的m6A位点已被注释，而PFC包含最高比例的未注释位点（26.05%）及最多的仅含未注释位点的基因（1,018个）（图4H）。功能富集表明，这些新位点的相关基因显著富集于突触可塑性调控、突触信号传导和行为等高级脑功能，而已注释位点基因多参与基础过程（如RNA剪接、蛋白质分解代谢等过程），表明PFC在表观转录组层面的独特复杂性。

4. 脑区特异的m6A修饰模式

研究发现67%的修饰异构体为多脑区共享，仅33%存于单一脑区（图5A）。其中PFC的81%特异性修饰异构体不受表达量变化影响（表2）。细胞类型富集分析显示：PFC特异性修饰异构体显著富集于兴奋性神经元，CN关联星形胶质细胞，CB则与颗粒细胞及部分兴奋性神经元相关（图5B）。

图5 脑区特异性m6A修饰模式

表2 不同脑区基因和异构体的特异性 m6A 修饰和表达

此外，911个超修饰异构体中有45%跨脑区保守，这些超修饰异构体在所有脑区均显著富集于兴奋性神经元，并高度关联突触功能、学习和认知等功能。其中，TUG1 lncRNA含有37个m6A位点，是修饰水平最高的基因，该基因与神经胶质瘤干细胞的更新和肿瘤发生相关（图5F）。

5. 同一基因内异构体的修饰差异

在11,512个包含共享基因组m6A位点的异构体中，828个异构体表现出显著的修饰率差异（图6B）。修饰率变化与m⁶A 位点到下游外显子边界的距离呈正相关（rho=0.51），距离增加时修饰率升高（图6C）。例如，SEPTIN4基因内同一位点在3'UTR的修饰率高于CDS区（图6D）；FYN基因中长3'UTR异构体（1407 nt）较短异构体（457 nt）修饰率高0.22（图6E）。线性回归模型分析进一步证实，外显子边界距离变化可解释40.9%的修饰率差异，且3'UTR区的修饰率普遍高于CDS区。

图6 同一基因内不同异构体的位点修饰率差异

6. 脑区间相同异构体的m6A修饰动态

通过xPore软件分析发现，同一异构体的m6A位点在脑区间存在显著修饰率差异。共鉴定出1658 个异构体上的 2218 个差异修饰（DM）位点，其中75.11%在 CB 中的修饰率升高，与CB整体高修饰水平一致（图7A）。这些DM位点显著富集RNA结合蛋白（RBP）结合位点（如UPF1、YTHDF1/2），其结合比例（约10%）显著高于普通m6A位点（约5%）（图7C-D）。值得注意的是，UPF1（RNA降解因子）在CB中表达上调，通过与m6A识别蛋白YTHDF1互作，促进CB中修饰RNA的降解（图7D）。精神分裂症风险基因SNAP91的四个异构体在CB中修饰率比CN中升高34%（图7E），而神经退行疾病相关NEAT1 lncRNA 在PFC/CN的修饰率较CB高32%（图7F）。

图7 脑区之间相同转录本m6A位点的修饰率差异

7. Poly(A)尾长与m6A的协同调控

比较不同脑区Poly(A)尾长比较发现，CN的中位长度较PFC和CB短（图8A）。3,545个异构体存在基因内Poly(A)长度差异（DPL），主要由异构体长度和3'UTR长度导致（如CALM3基因在PFC的异构体转换）（图8E）。联合分析显示，m6A修饰数量与Poly(A)尾长呈正相关（rho=0.15）。重要的是，同一基因内，具有远端Poly(A)位点（更长3'UTR）的异构体，相比其他异构体，具有更高的m6A修饰率和更长的Poly(A)尾长。且Poly(A)尾长增加的异构体与其在脑区中的上调表达存在明显交集。此外，不同脑区间Poly(A)尾长存在差异的异构体主要富集于突触相关和神经递质相关的功能或通路。

图8 脑区间异构体Poly(A)尾长量化及差异

研究总结

本研究创新性地通过DRS技术突破异构体水平的m6A检测瓶颈，揭示了人脑前额叶皮层、尾状核与小脑的特异表观转录组图谱：m6A修饰呈现显著的脑区和细胞类型特异性模式；同时异构体结构特征（如3'UTR长度和外显子边界距离）决定修饰率差异，以及Poly(A)尾长度可以与m6A修饰协同调控基因表达。这些发现为理解人脑复杂调控网络提供了新视角，为神经发育和疾病研究中异构体特异性调控研究指明了新方向。

参考文献：

Gleeson J, Madugalle SU, Wan CY, et al. Isoform-level profiling of m6A epitranscriptomic signatures in human brain. Sci Adv. 2025;11:eadp0783. doi:10.1126/sciadv.adp0783