单细胞转录组测序能够高灵敏度地检测稀有细胞群和差异表达基因，但其结果受样本质量、捕获效率、扩增偏差及生信算法影响。在得到每一个细胞的基因表达后，我们面临的真正挑战，是证明这些数据并非算法噪声，而是驱动疾病、发育或耐药的真实信号。

单细胞转录组测序为我们绘制了史无前例的“分子地图”，但如果没有系统的验证实验，这张地图就只是一张悬而未决的草图。后续的功能扰动、原位杂交、谱系追踪与临床队列验证，像一道道“实地勘测”，告诉我们在单细胞维度上锁定的稀有细胞亚群、关键转录因子和潜在靶点究竟能否经得起生物学与医学的拷问。可以说，验证实验不仅决定了一篇单细胞论文的深度与可信度，更直接左右着从实验室到病床的转化命运。今天，我们就用一篇推文，系统复盘那些单细胞转录组研究中常见的验证实验。

表达水平验证

表达水平的验证实验用于确认基因表达模式的准确性，尤其是关键差异表达基因（DEGs）或细胞类型标志物。

1、实时荧光定量PCR（quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）是一种在DNA扩增过程中，通过荧光信号实时监测产物量，从而实现对起始模板精确定量的技术，常常用于验证特定基因在目标细胞群体中的表达水平，与scRNA-seq数据相关性分析。

图1. 通过qRT-PCR和Tanswell实验明确SEC16B在骨肉瘤细胞系中的表达特点及功能

例如，发表在FASEB BioAdvances上的题为“Single-Cell RNA Sequencing Reveals the Critical Role of SEC16B in Lung Metastasis of Osteosarcoma”的文章中，scRNA-seq鉴定出五个肿瘤细胞亚群，其中C1亚群与肺转移表型最具相关性。将hdWGCNA分析筛选的肺转移相关基因与bulk RNA-seq的差异表达基因进行交叉验证，最终确定SEC16B是调控肺转移的关键基因。随后研究者使用qRT-PCR验证SEC16B在骨肉瘤细胞系中表达显著下调，Transwell实验证实SEC16B过表达能显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力。

2、流式细胞术（Flow Cytometry）或质谱流式（CyTOF）：它们都是在单个细胞水平上进行高通量分析的强大工具，通过蛋白标记（如表面标志物或胞内蛋白）验证细胞亚群的存在及其比例。

图2. 展示了年轻与老年OA患者外周血中总B细胞(A)、CD24+B细胞(B)、IgM-B细胞(C)、调节性B细胞(Breg，D)及记忆B细胞(E)的比例变化

例如，发表在International journal of surgery上的研究型论文“Multi-omic profiling reveals age-specific blood biomarkers and aging-driven B Cell remodeling in osteoarthritis.”中，使用scRNA-seq分析揭示了年龄特异性的B细胞分化模式，老年膝骨关节炎患者富集于活化B细胞亚群（C1），随后便使用流式细胞术检测年轻患者和老年患者外周血中B细胞各个亚型的比例，揭示了各B细胞亚型在两类患者中的特异性表达特点。

图3.使用scRNA-seq与流式细胞术对22份样本骨髓细胞类型群体频率的比较

发表在JCI insight上的“Human bone marrow assessment by single-cell RNA sequencing, mass cytometry, and flow cytometry.”研究中，同时使用了scRNA-seq、流式细胞术和质谱流式对20位年龄跨度较大的健康成人供体骨髓细胞进行了综合评估，发现即使在结果上略有不同（比如在T淋巴细胞和自然杀伤细胞群体的定量分析中存在差异），这三种技术依然表现出很强的相关性。

3、蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）是一种用来检测和半定量分析特定蛋白质的分子生物学技术。通过电泳分离蛋白质混合物，并将其从凝胶转移至膜上，再利用特异性抗体（一抗）识别目标蛋白，最终通过标记的二抗显色或发光，实现对特定蛋白质的定性或相对定量检测。通常用来对Marker基因进行鉴定定量。

图4. Western印迹分析Trem2、Lmna和Aif1的蛋白表达水平

例如，发表在Molecular and Cellular Biochemistry上的“Integrative single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the functions of TREM2 macrophages and infarct border dynamics post-myocardial infarction.”使用了scRNA-seq、空间转录组测序和Bulk RNA-seq筛选了心脏组织中细胞间通讯以及相关分子的特异性变化，而后在MI和I/R小鼠模型中通过WB、RT-PCR等技术对这些关键分子进行验证。

细胞类型/状态验证

1、免疫荧光技术（Immunofluorescence, IF）是一种利用抗原-抗体特异性结合原理，通过荧光标记在细胞或组织中定位目标蛋白（或其它抗原）的显微成像技术。其核心是通过荧光信号可视化目标分子的分布、表达水平及亚细胞定位。所以，IF在scRNA-seq中常常被用来确认关键标志蛋白在特定细胞亚群中的表达，揭示目标蛋白在组织中的空间分布。

图5. 共聚焦免疫荧光图像：左侧显示scRNA-seq鉴定的特征标记阳性CXCR2+中性粒细胞，右侧为标记表达减弱的CXCR2-中性粒细胞

发表在blood上的“Deciphering neutrophil dynamics in the focal lesion tumor microenvironment to overcome immunosuppression in multiple myeloma.”中，为交叉验证前文scRNA-seq数据，研究者采用特定标记物染色的共聚焦显微镜技术对三个亚群进行了可视化观察。从FL样本中分选出C5AR1+CXCR2+和C5AR1+CXCR2-中性粒细胞，根据scRNA-seq分析鉴定的差异表达标记物（图5D），研究者对未成熟与成熟中性粒细胞进行染色标记，包括CD10、TREM1、RETN、LCN2、CXCL8和TNFAIP3。

2、免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：与IF原理相同，是一种利用抗原-抗体特异性结合原理，通过标记抗体（酶、荧光或金属颗粒等）在组织切片或细胞涂片上原位检测并定位特定蛋白质（或其他抗原）的表达及分布的组织学技术。

图6 乳腺癌样本中亚精胺(SPD)免疫组化染色的代表性图像

图7. 乳腺癌组织中高/低亚精胺水平样本的CD8(红色)、GZMB(黄色)和亚精胺(白色)mIHC染色代表性图像

例如，Journal of Cancer的一篇研究性论文“Spermidine potentiates anti-tumor immune responses and immunotherapy sensitivity in breast cancer”中，研究者通过免疫组化与多重免疫组化验证（IHC/mIHC）证实，亚精胺合成增加的乳腺癌标本中活化CD8⁺T细胞数量显著增多，验证了生物信息学分析得出的结论。

3、荧光激活细胞分选技术（FACS）：是一种种以流式细胞术为基础，通过检测单个细胞表面或内部的荧光信号，并结合散射光参数，将异质性细胞群体中符合设定条件的靶细胞以高纯度、高活性分选出来，同时可进行多参数定量分析的技术。

图8. 类器官的细胞类型组成与增殖分析

例如，发表在nature communications上的名为“Aberrant pace of cortical neuron development in brain organoids from patients with 22q11.2 deletion syndromeassociated schizophrenia”的研究中，研究者采用FACS技术验证单细胞RNA测序分析提示的神经元数量减少现象。从所有DIV20类器官中分离纯化的神经前体细胞（SOX2 +）形成三维神经球，随后在神经分化培养基中培养7天后解离为单细胞。细胞经固定处理后，使用SOX2和CTIP2进行免疫染色，并通过FACS分析神经球中各细胞类型的占比。

4、荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）：一种利用荧光标记的核酸探针，在完整细胞、染色体或组织切片中原位与互补的靶DNA/RNA序列特异性结合（杂交），通过荧光显微镜直接观察并定位特定核酸序列存在、数量及空间分布的分子细胞遗传学技术。在scRNA-seq的应用中，可以直接可视化目标RNA在组织或细胞中的空间表达（如smFISH、MERFISH）。

图9. SR(n=3)与AF(n=3) COL1A1基因荧光原位杂交及定量

例如，发表在Molecular Medicine的“Single-cell RNA sequencing reveals the contribution of smooth muscle cells and endothelial cells to fibrosis in human atrial tissue with atrial fibrillation”中，scRNA-seq分析发现，胶原蛋白、弹性蛋白、细胞外基质以及肌动蛋白分化相关基因（如COL3A1、ELN、SPARC、TPM1和ACTA2）在AF的FB3细胞中显著升高。多色荧光原位杂交（mFISH）检测显示，COL1A1基因在AF组的表达量高于SR组（图9I和J）。

功能实验验证

1、CRISPR-Cas9 技术：一种基于细菌获得性免疫系统开发的可编程基因编辑技术。通过向导RNA（gRNA）引导Cas9核酸酶在目标基因组位点产生特异性双链断裂，随后利用细胞自身的同源重组或非同源末端连接修复机制，实现对目标基因的敲除、插入、替换或精确修饰，具有高效、简便、成本低、多基因同时编辑等优势。研究者们常常利用此项技术敲除细胞的某个或者多个功能基因，观察表型变化（如增殖、分化、迁移）。

图10. 利用脂质纳米颗粒递送CRISPR-Cas9靶向皮肤细胞焦亡通路缓解小鼠模型中的银屑病症状

例如，在“Comprehensive analysis of pyroptosis-related genes in psoriasis and targeted gene editing of CASP1 and CASP5 using lipid nanoparticles to alleviate skin inflammation”中，研究者通过脂质纳米颗粒递送CRISPR-Cas9系统靶向敲除角质形成细胞中的CASP1和CASP5基因，在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中产生显著治疗效果。

2、RNA干扰（RNA interference，RNAi）：一种在真核生物中利用短双链小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA），通过与靶mRNA序列特异性互补配对，诱导RNA诱导的沉默复合体（RISC）介导的mRNA降解或翻译抑制，从而在转录后水平高效、特异、可逆地抑制目标基因表达的分子生物学技术。

图11. 敲除HMGA1后对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

例如，发表在Frontiers in Immunology上的“Single-cell technology reveals the crosstalk between tumor cells and immune cells: driving immune signal transduction and inflammation-mediated cardiac dysfunction in the tumor microenvironment of colorectal cancer”研究中，研究团队分析了所有肿瘤亚群中五种主要转录因子的表达情况并系统比较了这些转录因子在不同肿瘤细胞亚群及细胞周期时相中的表达水平。发现其中HMGA1在C2 MKI67+ T细胞中表达最高，随后，研究团队对HCT116和HT-29两种结直肠癌细胞系进行了HMGA1基因敲除实验，观察基因敲除对细胞表型的的影响以推测该基因的生物学功能。

3、谱系追踪技术（lineage tracing）：一套在多细胞生物体内或体外培养体系中，通过可遗传、不可逆的细胞标记（如荧光蛋白、DNA条形码、Cre-loxP 诱导的永久标记等），对单个祖细胞及其所有子代细胞进行连续标记、追踪和鉴定的技术体系；用于在时间和空间维度解析细胞增殖、分化、迁移及命运决定过程，从而重建完整细胞谱系树，揭示发育、稳态维持、再生及疾病发生中的细胞来源与命运规律。

图12. 免疫荧光和内皮细胞谱系追踪证实免疫调节性内皮细胞源自急性心肌梗死后早期反应中既存的内皮细胞

例如，发表在Circulation research上的研究文章“Immunoregulatory Endothelial Cells Interact With T Cells After Myocardial Infarction”中，研究者通过scRNA-seq分析发现了一种短暂存在的髓系CD45+CD11b+Cdh5+免疫调节性内皮细胞表型（IMEC），在心肌梗死后1至3天出现。通过骨髓移植和谱系追踪实验证实，IMECs源自Cdh5+组织驻留细胞。

数据一致性验证

在scRNA-seq研究中，数据一致性验证是确保实验结果可靠性、可重复性和生物学真实性的关键步骤。其核心目的是通过独立实验或数据分析方法，验证scRNA-seq的发现（如细胞亚群、差异表达基因、通路激活等）是否真实存在，而非技术噪音或批次效应导致的假阳性结果。

图13. CD38高表达单核细胞作为脓毒症新型标志物的鉴定

例如，在Advanced science发表的“Identification of CD38high Monocyte as a Candidate Diagnostic Biomarker and Therapeutic Target for Sepsis”的研究中，包含一个scRNA-seq队列，每组由3名患者组成：脓毒症患者、被视为无菌炎症对照的心脏手术患者（手术组）、七天后康复的脓毒症患者（康复组），以及年龄和性别匹配的健康供体（HC），此外还从公共数据库获取了14名脓毒症患者和10名轻度感染患者数据，用于扩大样本量和数据一致性验证，同时，研究者进一步分析了已发表的脓毒症单核细胞bulk RNA-seq表达研究中的独立队列，验证了脓毒症患者体内CD38的mRNA表达水平显著高于健康对照组。

好啦，以上便是小编总结的在scRNA-seq研究中常用的验证实验，当然，相关实验并非只有以上这些，除此之外，多组学交叉验证也是常用的验证方法，例如，运用scRNA-seq与空间转录组联合可以直接关联基因表达与组织学结构，与蛋白组学联用验证转录组与蛋白表达的一致性，与ATAC-seq或ChIP-seq联用确认关键转录因子的调控关系（如染色质可及性、结合位点）等等。具体使用哪种策略进行验证，大家可以根据自己课题组的实验条件进行选择。

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