N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物 mRNA 中最丰富的转录后修饰，参与 RNA 稳定性、剪接和翻译调控等多种生物学过程。然而，m⁶A 在不同 RNA 异构体及其在单细胞中的分布异质性尚不明确。传统检测方法（如MeRIP-seq、DART-seq）受限于RNA片段化或单核苷酸分辨率不足，难以解析不同RNA异构体的m⁶A修饰模式。

近日，中山医学院王金凯教授课题组与美国的费城儿童医院联合在《Nature Communications》上发表了题为“Isoform characterization of m6A in single cells identifies its role in RNA surveillance”的研究论文。该研究开发了 m⁶A-isoSC-seq 技术，基于Oxford Nanopore测序平台对单细胞cDNA文库进行测序，结合APOBEC1-YTH 诱导 m⁶A 位点附近的 C-to-U 突变，系统绘制了单细胞分辨率的异构体水平m⁶A修饰图谱，并发现 m⁶A 通过靶向降解异常加工的RNA 异构体（如内含子多聚腺苷酸化转录本）参与RNA监测，为理解 m⁶A 在基因表达精准调控中的作用提供了新视角。

英文标题：Isoform characterization of m6A in single cells identifies its role in RNA surveillance

发表期刊：Nature Communications

发表时间：2025年7月

影响因子：15.7

贝纳基因参与了该项目的单细胞cDNA Nanopore测序工作

主要研究结果

1. eDART-seq 技术显著提升 m⁶A 检测灵敏度

为提升 m⁶A 检测效率，研究团队对已有DART-seq技术进行了优化，构建了增强型DART-seq（eDART-seq）方法。该方法在 APOBEC1-YTH 载体中加入 copGFP 标签和 T2A 自剪切肽（图 1a），通过流式分选高荧光强度细胞，显著提高 C-to-U 突变效率（图 1b-c）。在 HEK293T 细胞中，使用eDART-seq 方法鉴定出 199,227 个 C-to-U 突变位点，数量是常规 DART-seq 技术的 4.9 倍。

这些突变位点富集于 DRACH motif和终止密码子附近（图 1d），与常规DART-seq方法结果一致。值得注意的是，尽管 eDART-seq 在单碱基分辨率 m⁶A 检测结果与GLORI结果相关性较弱，但在区域水平的 m⁶A 突变peak分析中表现出显著正相关（图 1h），为单细胞 m⁶A 异质性研究奠定基础。

图 1 eDART-seq 提升 m⁶A 检测能力

2. 单细胞聚类揭示 m⁶A 修饰的细胞类型特异性 

基于混合培养的 HEK293T、HeLa 和 HepG2 细胞群体，研究通过m⁶A-isoSC-seq技术，对同一单细胞 cDNA 文库进行了 Oxford Nanopore 长读长与 Illumina 短读长双平台测序（图 2a）。其中基于 Illumina 数据的基因表达谱可以成功区分三种细胞类型，并且基因表达与单细胞水平m⁶A丰度之间呈显著负相关。通过分析 11,951 个 m⁶A 突变peak，发现即使仅基于非差异表达基因的m⁶A修饰特征，也足以将细胞准确划分为三个簇（图 2e-f），各簇中90%以上的细胞均正确归类于其源细胞系（图 2g），表明 m⁶A 修饰具有显著的细胞类型特异性。这一发现首次证实 m⁶A 修饰模式可作为独立的细胞身份标识。值得注意的是，混合细胞间m⁶A异质性的主要来源是发生甲基化的细胞比例，而非单个细胞内基因的甲基化程度（图 2j）。

图2 m⁶A的单细胞水平表征

3. 纳米孔长读长测序实现单细胞异构体 m⁶A 解析

研究进一步通过 Oxford Nanopore 长读长测序解析同一单细胞 cDNA 文库，鉴定到 3800万条 reads含有细胞 barcode 和 UMI（图 3a），其中 61.1% 的reads覆盖转录本90% 以上区域。基于无差异表达的转录本的 m⁶A 修饰水平的聚类分析显示，细胞仍可清晰分为三个细胞簇，结果与Illumina短读长聚类结果一致（图 3f），且各簇主要细胞类型占比达 79%-95%（图 3h）。值得注意的是，基于异构体的 m⁶A 水平可将HEK293T 细胞分为三个细胞亚群（图 3i），其中 Cluster 2 高表达细胞解毒相关基因（图 3j），表明 m⁶A 异质性与细胞应激状态密切相关。

图3 m⁶A的单细胞异构体水平表征

3. m⁶A 通过负向调控影响异构体表达

在 HeLa 细胞中，516 个异构体呈现 m⁶A 水平与其表达量呈显著负相关（图 4a），且甲基化程度显著高于其他异构体（图 4b），外显子数量显著少于其他异构体（图 4d），这与之前的报道一致，由于外显子链接复合体（EJC）对m⁶A修饰存在抑制作用，外显子较少的mRNA通常具有更高的m⁶A修饰水平。通过比较同一基因的不同异构体，鉴定出 507 个高甲基化异构体（HMIs） 和 354 个低甲基化异构体（LMIs）（图 4e），HMIs 的表达水平显著低于 LMIs（图 4f）。在HeLa细胞中，68.2% 的HMIs具有细胞特异性（图 4g），如 EEF1D-202 在 HeLa 中呈现高 m⁶A 水平低表达，而在 HEK293T 和 HepG2 中无此规律（图 4k-m）。这种特异性调控揭示 m⁶A 可作为细胞类型依赖的异构体表达开关。

图4 特异性甲基化异构体具有细胞系特异性

5. 异常 RNA 异构体呈现特异性 m⁶A 高甲基化

与LMIs相比，HMIs具有更少的外显子数量，特别是具有 ≤4 个外显子的异构体比例显著更高（图 5a-b）。同时发现，外显子数量与m⁶A水平之间存在高度负相关，外显子不超过四个的转录本m⁶A水平明显更高（图5c），这一规律在ONT直接RNA测序分析（DRS）中也得到验证（图5d）。在 HeLa 细胞中，8.3% 的HMIs为内含子多聚腺苷酸化（IpA）RNA异构体，而LMIs中仅占 2.5%（图 5e）。基于DRS数据的分析进一步证实，IpA异构体的 m⁶A 位点距其最近的（外显子-外显子）剪接位点的距离显著长于经典异构体（图 5h）。例如，含 2 个外显子的 IpA 异构体RAD51C-203的 m⁶A 水平显著高于含 9 个外显子的经典异构体RAD51C-201（图 5i-j）。

图5 内含子多聚腺苷酸化异构体具有高m⁶A甲基化水平

6. m⁶A 通过 CMD 途径靶向降解异常 RNA 

研究发现，除了IPA异构体外，异常剪接的 RNA（如NMD异构体、非编码异构体以及内含子保留异构体）在编码区（CDS）具有更高的 m⁶A 水平，且这一结果通过DRS分析得以验证（图 6b-c）。这些异构体在 METTL3 敲除后表达显著上调（图 6d），表明其稳定性受 m⁶A 调控。然而，通过 SMG1 抑制剂和 UPF1 siRNA 处理HEK293T细胞后进行DRS测序分析发现，这些异构体的表达变化与 m⁶A 水平无显著相关性（图 6k），表明 m⁶A 介导的降解独立于 NMD 途径。

图6 NMD异构体、内含子保留异构体及非编码异构体呈现高m⁶A甲基化特征

与此相反的是，CDS-m⁶A 衰变（CMD），一种通过核糖体停滞触发 YTHDF2-DCP2 依赖的降解机制，在清除异常 RNA 中发挥核心作用。IpA 转录本因在最后一个外显子含有>200 nt 的延长编码序列（图 7c），更易被 CMD 途径降解（图 7a, d-e）。同时，携带长内部外显子（≥400 nt）的基因也显著富集于 CMD 靶标中（图 7j-k），证实该途径通过识别异常结构实现 RNA 质量监测。

图7 CMD机制介导m⁶A依赖性错误加工异构体的降解

研究总结

本研究基于新开发的m⁶A-isoSC-seq技术首次在单细胞和异构体分辨率上解析了m⁶A修饰图谱，揭示 m⁶A 修饰具有显著的细胞类型和异构体异质性。研究发现IpA异构体和异常剪接异构体因其外显子数量较少、编码区延长等特殊结构，得以逃逸EJC的抑制，而呈现高m⁶A甲基化状态，并通过CMD途径被特异性降解。该工作不仅阐明了m⁶A在RNA质量监测中的核心作用和调控机制，其建立的技术体系也为在细胞分化、发育等过程中研究m⁶A的动态变化提供了强有力的工具。

参考文献：

Ren Z, He J, Huang X, et al. Isoform characterization of m⁶A in single cells identifies its role in RNA surveillance. *Nat Commun*. 2025;16:5828. doi:10.1038/s41467-025-60869-0