研究介绍

mRNA 疗法在疫苗与治疗性蛋白表达方面展现出巨大潜力，但其在体内的不稳定性限制了其持久性与疗效。尽管环状 RNA、自扩增 RNA 等替代形式具有更长的半衰期，但这些模式常存在翻译效率低、修饰兼容性差、生产工艺复杂等问题。

为克服这些限制，本研究系统筛选了来自 337 种病毒的 196,277 个基因组片段，从中鉴定出 11 个能显著增强 mRNA 稳定性与翻译效率的 RNA 元件。这些元件通过招募 TENT4 酶延长 poly(A) 尾，抵抗 CCR4–NOT 介导的脱腺苷化，从而提升 mRNA 的寿命与蛋白产量。其中，A7 元件在多种细胞类型、递送方式、碱基修饰和编码序列中表现尤为突出，使线性 mRNA 的稳定性接近于环状 RNA，同时具备更高的翻译效率。该研究为开发高表达、长寿命、低免疫原性的 mRNA 疗法提供了新策略。

Nanopore Direct RNA测序技术在该研究中用于精确量化poly(A)尾长和直接观测混合尾化现象，从而证实了病毒RNA元件通过TENT4依赖性机制增强mRNA稳定性。

文章标题：RNA stability enhancers for durable base-modified mRNA therapeutics

发表期刊：Nature Biotechnology

发表时间：2025年11月

影响因子：41.7

主要研究结果

1、已知 UTR 元件在碱基修饰 mRNA 中表现有限

研究首先评估了现有 mRNA 疫苗中使用的 3′UTR 元件（如 mRNA-1273 和 BNT162b2）以及前期发现的病毒来源增强子（K1–K9）在 m¹Ψ 修饰 mRNA 中的表现（图1a–c）。结果显示，大多数元件在修饰背景下活性丧失或显著降低，仅 K3 和 K4 保留部分功能。这表明传统 UTR 元件与碱基修饰之间存在兼容性问题，亟需开发新型稳定性增强元件。

图1 系统性筛选用于增强m¹Ψ修饰mRNA的病毒元件

2、系统性筛选鉴定出 m¹Ψ 兼容的病毒 RNA 元件

研究团队构建了一个覆盖 337 种病毒、共 196,277 个片段的文库，通过两轮筛选（基于 EGFP 荧光和 Luciferase 报告基因）鉴定出 131 个能显著增强 m¹Ψ 修饰 mRNA 稳定性的片段（图1d–f）。进一步验证后，选出 11 个代表性元件（A1–A11），其中 A1、A2、A4、A6 和 A7 在 m¹Ψ 修饰背景下仍保持超过 60% 的活性（图1g–h）。这些元件多数来源于疱疹病毒、乙肝病毒、小 RNA 病毒等，具有广泛的病毒来源多样性。

图2 RNA稳定性增强元件的基因组位置和预测的RNA结构

3、结构突变分析揭示功能关键区域

通过深度突变扫描（4,542 个突变体），研究揭示了这些元件的关键结构与序列特征（图3a）。大多数元件（如 A1、A2、A4、A6）含有一个保守的 CNGGN 五核苷酸环结构，其中第 1、3、4 位的 C、G、G 对其功能至关重要（图3d–e）。而 A7 则缺乏该 motif，其活性依赖于一个内部环（IL）中的 “AGACCY” motif和另一个茎环（SL2）中的 “GCGCNARUD” motif（图3b–c）。

图3 深度突变分析揭示关键结构和序列特征

4、病毒元件通过 TENT4 依赖性混合尾化机制增强稳定性

研究通过抑制剂实验和基因敲除模型证实，所有 11 个元件的增强效应均依赖于 TENT4 活性（图4a–b）。使用 TENT4 抑制剂 RG7834 或敲除 TENT4 基因后，这些元件的稳定性增强作用被完全消除。并且通过高分辨率poly(A)尾巴测定（Hire-PAT）证实这些元件可显著延长poly(A)尾长（图4c）。

图4 病毒RNA稳定性增强子通过TENT4依赖性混合尾化发挥作用

研究进一步通过Nanopore 直接 RNA 测序（DRS）技术精确量化了这一现象：对照组mRNA转染12小时后，poly(A)尾长中位值从60 nt缩短至38 nt，而含A2和A7元件的mRNA中位poly(A)尾长分别延长至163 nt和91 nt（图4d）。更重要的是，基于纳米孔电流信号的特征分析，DRS首次在单分子水平上直接观测到“混合尾化”现象——在A2和A7元件的poly(A)尾区出现大量异常电流信号，表明存在非腺苷核苷酸的掺入；该现象同样可被TENT4抑制剂逆转，证实混合尾化依赖于TENT4活性。

此外，大多数含 CNGG 的元件通过TENT4辅因子ZCCHC14发挥作用，而 A7 则独立于 ZCCHC14 和 ZCCHC2（图4e–g），表明其可能通过未知适配蛋白招募 TENT4（图4h）。

5、A7 元件在多种细胞与分子背景下表现稳健

A7 在多种细胞系（如 HepG2、A549、MCF7、Jurkat 等）中均表现出广泛的活性（图5a），尤其在肝细胞和 T 细胞中效果显著。此外，A7 在 m⁵C 修饰 mRNA 中仍保持功能（图5b），显示出对多种碱基修饰的兼容性。与现有疫苗 UTR 相比，A7在转染后第3天和第5天蛋白产量分别提高65倍和114倍（图5c），且在多种 5′UTR、编码序列优化策略和膜蛋白表达背景下均能显著增强表达（图5d–h）。

图5 A7在多种细胞与不同分子背景下均起作用

6、A7 使线性 mRNA 稳定性媲美环状 RNA

在 HepG2 和 HCT116 细胞中，含 A7 的线性 mRNA 半衰期分别达 15.9 小时和 19.0 小时，与环状 RNA 相当（15.1 小时和 19.5 小时），远高于对照组线性 mRNA（6.0–6.2 小时）（图6a–c）。更重要的是，A7 线性 mRNA 在蛋白产量上显著优于环状 RNA，其 AUC 值在两种细胞中分别高出 5.3 倍和 5.8 倍（图6d–f），显示出更高的翻译效率与持久性。

图6 A7赋予线性mRNA类似circRNA的稳定性

7、A7 在小鼠体内实现长效蛋白表达

通过尾静脉注射 LNP 包裹的 mRNA 至小鼠体内，研究发现含 A7 的线性 mRNA 在肝脏中表达显著高于对照组和环状 RNA（图6g–i），且在注射后第 13 天仍可检测到明显荧光信号。至第 14 天，肝脏中仍保留可观的蛋白表达（图6j–k），证实 A7 在体内具有显著的长效表达优势。

研究总结

本研究通过大规模病毒基因组片段筛选，鉴定出一类新型 RNA 稳定性增强元件，其中 A7 表现尤为突出。这些元件通过招募 TENT4 介导的混合尾化机制，延长 poly(A) 尾，抵抗脱腺苷化，从而显著提升 mRNA 的稳定性与蛋白产量。A7 不仅在多种细胞类型、碱基修饰、编码序列和递送方式中保持活性，更使线性 mRNA 在稳定性上与环状 RNA相当，同时在翻译效率上更具优势。该研究为开发下一代长效、高效、低免疫原性的 mRNA 疗法提供了强有力的工具与理论基础，具有广泛的临床应用前景。

参考文献：

Jung, S.-J., Seo, J.J., Lee, S. et al. RNA stability enhancers for durable base-modified mRNA therapeutics. Nat Biotechnol (2025).