直接RNA测序（Direct RNA Sequencing, DRS）是一种基于牛津纳米孔测序（Oxford Nanopore）的技术，能够对天然状态的RNA进行测序，从而捕获包括全长转录本、可变剪接、多聚腺苷酸尾（poly(A)尾）长度以及多种RNA化学修饰在内的全面信息。

2025年发表于《Nucleic Acids Research》的研究《Direct RNA sequencing enables improved transcriptome assessment and tracking of RNA modifications for medical applications》系统评估了最新RNA004测序试剂盒及其集成修饰检测功能的新版碱基识别模型的性能。研究通过平行比较RNA004与RNA002技术，并利用体外转录对照、合成寡核苷酸及GLORI等高精度方法进行正交验证，全面展示了RNA004在通量、准确性和直接检测RNA修饰（如m⁶A和Ψ）能力上的显著突破。尤为重要的是，该研究首次在临床诊断中应用DRS，成功在一个患有严重神经发育障碍的患儿身上，证实了METTL5基因突变导致特定位点m⁶A修饰缺失，为罕见病诊断提供了全新的功能验证工具。

图1. DRS在临床治疗和分析中的应用

主要研究结果

1、RNA004测序试剂盒显著提升测序性能

研究团队通过25张测序芯片的系统对比发现，RNA004测序试剂盒在多种样本类型的测序通量、读长质量和碱基识别准确性方面均显著优于RNA002试剂盒（图2B, D）。RNA004的单张芯片最高产出可达30Gb，reads数可达22M，而RNA002的通量最高仅为RNA004的35%左右。同时RNA004测序质量值Q值在Q20以上，参考基因组比对率显著提高（平均接近98%）（图2C-F）。值得注意的是，RNA004在保持高精度的同时大幅降低了测序错误率，特别是在HEK293T样本中将U>C错配率从RNA002的~13%降至~3.67%，为精准检测RNA修饰奠定基础。 

图2. 所有样本的通用测序质量指标

2. 转录组覆盖度与基因表达分析能力增强

主成分分析（PCA）显示，样本按生物学类型而非测序试剂盒聚类，说明RNA004在提升性能的同时，很好地保持了转录组数据的生物学真实性（图3A）。基因覆盖度显示，RNA004试剂盒对基因的覆盖深度显著改善，可检测更多高覆盖度（≥10×）的基因，尤其在孟德尔疾病相关基因中覆盖比例达60%，表明其相较于RNA002更适用于临床转录组分析。 

图3. 转录组覆盖度与poly(A)尾长估计

3. poly(A)尾长估计准确性显著提升 

研究团队通过对比tailfindr算法与Dorado碱基识别模型中的poly(A)估计功能，发现二者在RNA002数据上高度一致（图3C）。利用已知约30nt尾长的RNA对照链验证显示，RNA004与RNA002对标准样本的尾长估计均准确无误（图3D）。在实际生物学样本中，RNA004对DDX17（长尾）、OLA1（短尾）和SRP14（中长尾）基因的poly(A)尾长分布检测与RNA002高度吻合（图3G-I），证明新试剂盒在poly(A)尾长估计方面的可靠性。 

4. m⁶A修饰检测的优化与临床验证 

通过设置修饰概率阈值≥0.98、覆盖度≥10×、位点特异性修饰率≥10%的过滤标准，RNA004在三个外周血生物学重复样本中分别检测到96,011、72,184、127,352个m⁶A位点，其中58,836个位点在三个生物学重复中共同检出（图4B）。与GLORI-seq（m6A检测金标准）的正交验证显示，技术间相关性系数达0.93以上（图4F-H），并且m6A修饰在DRACH motif中的分布模式与文献报道一致，而体外转录（IVT）对照样本中假阳性率极低（仅249个位点），证明Dorado模型检测m6A的高特异性。 

图4. m⁶A位点的全转录组分析及与GLORI测序的比较

5. Ψ修饰检测能力实现突破但挑战仍存

Dorado首次在官方生产级工具中实现了转录组范围内Ψ修饰的检测，在外周血样本中识别出23,456-47,435个潜在Ψ位点（图5A-B）。然而，不同生物学重复间仅有4,555个位点重叠，且修饰频率分布多集中在10%的检测阈值附近（图5C），表明Ψ检测的可重复性仍待提升。与RMBase v3.0数据库对比显示，RNA004可识别约20%已知Ψ位点。同时，研究指出，基于U>C错配策略在RNA004中的效用随着基础错误率降低而减弱。

图5. DRS检测到的Ψ位点的全转录组分析

6. 靶向报告系统验证Ψ修饰位点的检测效能

利用Schartel等开发的靶向Ψ修饰报告系统，研究团队在EGFP和mCherry报告基因的特定位点验证了Ψ化学计量差异（图6A）。当结合Dorado的Ψ调用结果与U→C错配分析时，完全修饰的EGFP和mCherry基序检测准确率分别达到98.38%和93.77%（图6G），样本B中mCherry与EGFP的修饰比率差异（9.6倍）与实验设计预期完全一致，证明DRS在RNA疗法（如mRNA疫苗）的质量控制中具有巨大应用潜力。 

图6. 位点特异性Ψ修饰分析

7. 首次证实METTL5突变导致m⁶A修饰缺失

针对一例携带METTL5复合杂合突变（c.224+5G>A [p.(?)] 和 c.427A>T [p.(Lys143*)]）的智力发育障碍患者中，研究通过DRS技术首次在临床样本中验证了RNA修饰酶的功能缺失（图7A-C）。DRS结果显示约50%的METTL5转录本发生外显子2跳跃，同时18S rRNA A1832位点的m6A修饰率显著低于健康对照（图7F-G）。这一发现不仅为该例患者的基因变异提供了功能层面的致病性证据，更开创了DRS技术在罕见病诊断中的应用先例。 

图7. 通过DNA测序在患者METTL5基因中发现的位点特异性m⁶A修饰缺失和突变

研究总结

本研究通过系统验证RNA004测序试剂盒与Dorado修饰识别模型在检测精度、通量和修饰识别方面的突破性进展，确立了DRS技术在RNA疗法质量控制、罕见病诊断和肿瘤表观标志物发现等临床场景的应用潜力。尽管在Ψ修饰检测的重复性和临床级标准化流程方面仍存挑战，但随着技术优化和临床级基准数据集的建立，DRS有望成为RNA表观遗传学研究与临床诊断的新标准。

参考文献：

Hewel C, Wierczeiko A, Miedema J, et al. Direct RNA sequencing enables improved transcriptome assessment and tracking of RNA modifications for medical applications. Nucleic Acids Res. 2025;53:gkaf1314. doi:10.1093/nar/gkaf1314 

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkaf1314