英文标题：Analysis genome of Pseudotaxus chienii reveals insights into the origin and evolution of taxane biosynthesis

发表期刊：Nature Communications （IF=15.7）

发表时间：2025.12

2025年12月，杭州师范大学生命与环境科学学院沈晨佳团队在《Nature Communications》在线发表最新研究成果，首次完成白豆杉（Pseudotaxus chienii）染色体水平高质量基因组图谱（15.6 Gb）。研究发现，由于白豆杉缺失关键酶紫杉烷2α-O-苯甲酰基转移酶（TBT），其紫杉醇生物合成通路在10-去乙酰巴卡亭III（10-deacetylbaccatin III）之前截断，导致中间产物紫杉素（taxusin）大量积累。

该研究通过比较基因组分析揭示了红豆杉科紫杉烷合成基因簇的共同起源，并阐明红豆杉属如何通过演化获得关键酶，最终形成完整的紫杉醇（Taxol）合成途径。这项研究不仅填补了白豆杉基因组和紫杉醇生物合成演化研究的空白，也为未来药用活性成分开发提供了重要基础。

贝纳基因参与了白豆杉基因组的测序及基因组分析等工作

研究背景

红豆杉科（Taxaceae）是重要的裸子针叶植物类群，既具有显著的药用价值，也在生态系统中发挥重要作用。隶属于红豆杉科的红豆杉属（Taxus）因能够合成紫杉醇（Taxol），其生物合成通路的起源与演化受到广泛关注。白豆杉（Pseudotaxus chienii）为中国特有濒危树种，是红豆杉属的姐妹群，其演化分化距今约 5400–6500 万年，是研究紫杉烷类代谢起源与演化的重要系统材料。

尽管红豆杉科植物中紫杉烷类化合物已在多种物种中被发现，但其完整生物合成通路及演化机制尚不清楚。白豆杉作为古老而稀有的代表物种，其基因组信息长期缺乏，使得解析红豆杉科紫杉烷代谢的起源与演化成为挑战。

本研究利用HiFi测序与染色体构象捕获（Hi-C）技术，首次完成白豆杉染色体水平高质量基因组组装，为深入揭示紫杉烷生物合成的起源与演化提供了坚实基础，同时为未来药用活性成分开发与红豆杉科植物保护提供了全新视角。

研究结果

1、白豆杉（P. chienii）茎和叶中代谢物分布的可视化分析

白豆杉是一种珍稀裸子植物，其药用活性成分尚未被系统研究。本研究利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱（MALDI-IMS）技术，对白豆杉茎和叶的二萜类化合物进行空间分布可视化（图1a-c）。分析显示，不同组织中代谢物具有显著的特异性积累模式：茎部的表皮、木质部、髓部和内皮层各自富集不同代谢物，叶片的表皮、叶肉组织和维管束鞘也呈现独特分布。

进一步分析发现，多种具有生物活性的二萜类化合物在茎叶中表现出组织特异性。例如，香叶基焦磷酸及植烷酸主要积累于表皮，而紫杉碱 B 等化合物在木质部中富集；部分代谢物如 erinacine D、azadirachtin 等则无明显组织偏好（图1d–e）。这些结果揭示了白豆杉茎叶中二萜类化合物的空间分布特征，为深入研究其活性成分及代谢机制提供了直观参考。

图1 timsTOF flex MALDI-2数据分析

(a) 白豆杉（P. chienii）枝条图。蓝色线表示叶片取样位置，红色线表示茎部取样位置。

(b) 白豆杉叶片和茎部切片的光学显微图像。

(c) 白豆杉样品的平均质谱图及分割分析。茎和叶样品在同一芯片上进行测定。

(d) 白豆杉叶片和茎部中十种典型二萜类化合物的成像分析。颜色刻度范围为 0–100%，蓝色表示低积累，红色表示高积累。

(e) 叶片和茎部中各类代谢物的比例柱状图。

2、基因组组装与注释

本研究采集了一株野生白豆杉（P. chienii）嫩枝，构建其染色体水平高质量基因组（图2a）。获得652.4 Gb Illumina（～39×）数据，基于19-mer分析，估算白豆杉基因组大小约为 16.8 Gb。随后利用586.5 Gb PacBio HiFi数据，组装得到15.6 Gb contig序列，结合2.34 Tb Hi-C数据，将组装的15.5 Gb（99.0%）contigs挂载到12条伪染色体上，挂载率达99.0%（图2b）。评估结果显示，Illumina基因组数据和转录组数据比对率分别为99.33%和98.58%。BUSCO为85.2%，LAI值为10.1，表明该基因组完整性和质量均处于高水平。基因注释共预测到35,404个蛋白编码基因。

相比近缘红豆杉属（Taxus，约10 Gb），白豆杉基因组显著更大，其重复序列比例高达 86.12%，其中TEs占82.73%，串联重复序列占3.39%。LTR-RT是主要组成部分，占所有TEs的82.06%，其中 Gypsy 和 Copia 家族分别占 40.87% 和 9.04%。LTR插入时间分析显示，白豆杉的LTR-RT扩增经历了漫长时期，约60–10 MYA内持续累积，并在约23 MYA达到峰值（图 2c–d）。这表明，LTR-RT的长期活跃是导致白豆杉基因组偏大的重要原因。

图2 白豆杉（P. chienii）的基因组特征

(a) 用于基因组 DNA 测序的野生白豆杉植株照片。

(b) 白豆杉基因组的 Circos 图。I 表示染色体长度（Gb）；II 和 III 分别表示 GC 含量和基因密度；IV–VI 表示基因在未处理或 MeJA 处理下的表达水平；VII–IX 分别显示转座子、Gypsy 和 Copia LTR 的分布。

(c) 基于总 LTR 的插入时间分析。

(d) 基于不同类型 LTR 的插入时间分析。

(e) 白豆杉、T. grandis、T. mairei、T. yunnanensis和T. wallichiana的直系同源蛋白编码基因簇Venn图。

(f) 绿色植物进化过程中基因家族的扩张与收缩。基于若干低拷贝直系同源基因群构建最大似然系统发育树。分支上的数字表示每个节点处扩张（红色）和收缩（绿色）基因家族的数量。

3、全基因组复制分析与基因家族演化

该研究对白豆杉（P. chienii）与红豆杉科近缘物种（Torreya grandis和T. mairei）的共线性分析显示，白豆杉分别有约86%和81%的基因在T. mairei和T. grandis中保持一对一同源关系，仅少量基因呈现一对多关系，提示其最近未发生全基因组复制（WGD）。进一步通过同源共线基因块来探索白豆杉WGD的演化遗迹，仅发现60个基因块（约672个基因，占基因组总量的2%），进一步支持白豆杉缺乏近期WGD的结论。三种红豆杉科物种间宏观共线性高度保守，但白豆杉与T. grandis相比，存在更多染色体重排和倒位事件，反映出物种系统发育关系和基因组结构演化差异（图2b、2c）。

在基因家族演化方面，白豆杉与其他物种共有10,419个核心基因家族，同时白豆杉有5,977个特有基因家族（图2e）。在16种陆生植物中共鉴定20,986个直系同源组，基于184个拷贝基因的系统发育分析，显示白豆杉约在4,830万年前与红豆杉属分化。进一步分析发现，红豆杉科祖先共有190个扩张基因家族和1个收缩基因家族，而白豆杉属和红豆杉属祖先分别显示73个和38个基因家族发生扩增和收缩；红豆杉属特有谱系中有170个扩增和32个收缩基因家族（图2f）。这些扩增基因家族在白豆杉中主要涉及代谢、次生代谢、非生物胁迫响应及生殖相关功能，可能与其适应性和物种独特性密切相关。

4、功能基因鉴定与紫杉烷类生物合成潜力

对白豆杉（P. chienii）基因组分析显示，其富含环境适应和代谢相关基因。其中，587 个基因富集到“paclitaxel biosynthetic process” GO条目，提示其具备紫杉烷类生物合成潜力；转录因子分析显示，共鉴定591 个TF基因，主要代谢相关家族未发生大规模扩增，反映基因组的相对古老性。

系统分析表明，白豆杉保留完整MEP（2-C-甲基-D-赤藓糖醇磷酸）前体途径，部分紫杉烷合成相关基因主要聚集在染色体9（142.04–245.71 Mb）和11（16.56–101.93 Mb）形成两个基因簇（图3a–b），但关键酶TBT和BAPT未检测到（图3a），导致紫杉醇通路在10-去乙酰巴卡亭III 处截断并积累中间产物紫杉素（taxusin）。与红豆杉属（T. wallichiana）染色体10对应区域比较显示，这些基因簇经历了易位和倒位，但仍保留共同祖先谱系（图3c），揭示了紫杉烷类生物合成通路在红豆杉科内的共同起源。

图3 紫杉烷类生物合成途径的起源与演化

(a) 可能的紫杉醇生物合成途径。实线箭头表示已鉴定的反应，虚线箭头表示未知反应。红色叉号表示白豆杉（P. chienii）中缺失的基因。

(b) 紫杉烷类生物合成相关已知基因概览。

(c) P. chienii与T. wallichiana之间的基因组重排。提取自P. chienii基因组的染色体9（142.04–245.71 Mb）和染色体11（16.56–101.93 Mb）区域，以及T. wallichiana基因组染色体10（195.41–486.53 Mb）区域的物理和遗传图谱。

5、紫杉烷类代谢物Taxusin：白豆杉（P. chienii）潜在的终产物之一

为了比较三种典型红豆杉科物种的代谢差异，该研究对白豆杉、T. wallichiana和 T. grandis进行了非靶向代谢组学分析。PCA 显示三者代谢组明显分离，基因组比较表明，三种物种均具备完整的MEP前体途径（图4a）。白豆杉缺失关键酶TBT和TOT1（亦称 CYP1/CYP725A55），可能导致无法合成 10-去乙酰紫杉醇 III及下游中间体，同时可能促使代谢流重定向至taxusin或其类似物（图4b）。

代谢物检测显示，taxusin在白豆杉中高度积累，尤其是茎部，而在T. wallichiana中含量低，在T. grandis中未检测到；10-去乙酰紫杉醇III仅在T. wallichiana中显著积累（图4c）。LC-MS/MS测定表明，白豆杉嫩枝中taxusin含量比T. wallichiana高约3.5倍（图4d–e）。非靶向分析还发现，紫杉醇及其衍生物仅在T. wallichiana中检测到（图4f）。这些结果表明，taxusin是白豆杉紫杉烷类代谢中潜在的主要终产物及紫杉醇前体。

图4 白豆杉（P. chienii）中taxusin的积累情况

(a) 紫杉烷类生物合成中各关键酶编码基因的数量。

(b) 白豆杉中推测的代谢通路块示意图。

(c) 白豆杉、T. wallichiana和T. grandis中taxusin与10-去乙酰巴卡亭III的含量测定。

(d) 白豆杉和T. wallichiana中taxusin的质谱图。

(e) 白豆杉和T. wallichiana嫩枝中taxusin的含量。****P<0.0001。数据以六个生物重复的均值±标准差表示。

(f) 紫杉醇及其衍生物含量测定。

6、TS基因功能鉴定与TPS蛋白结构分析

迄今为止，在裸子植物中，红豆杉属（Taxus）是唯一已知能合成紫杉醇的属。TS（taxadiene synthase）属于TPS（terpene synthase）家族，催化GGPP转化为紫杉烷类核心结构，是紫杉醇生物合成的起始关键步骤。系统发育分析显示，裸子植物的TPS形成独立群体，而被子植物的TPS分为Class I和Class II两个分支（图5a）。为验证白豆杉（P. chienii）PcTS1功能，该研究构建pBWA(V)HS-PcTS1载体并转入烟草获得转基因幼苗（图5b）。GC-MS分析显示，PcTS1表达叶片产生了与taxadiene类似物保留时间为11.875分钟的峰（图5c–d），表明PcTS1可在异源系统中催化紫杉烷类生成。

红豆杉科TPS属于Class I，而其他裸子植物TPS为双功能型（bifunctional）。多序列比对显示，红豆杉科TPS缺失典型DXDD基序，但保留DDXXD/E和(N,D)DXX(S,T)XXXE基序（图5e）。基于T. brevifolia TS的X射线晶体结构，利用 SWISS-MODEL预测PcTS1三维结构及Mg²⁺结合位点，发现形成DDXXD/E和 (N,D)DXX(S,T)XXXE基序的残基环绕在催化活性位点，提示DXDD对活性非必需（图 5f）。该研究进一步对六种典型TPS的结构分析显示，PcTS1与双功能TPS的结构相似性最高，与Class II TPS相似性最低（图5g）。这些结果揭示了白豆杉TS的功能特性及红豆杉科TPS的独特演化模式，为紫杉烷类生物合成的结构与功能研究提供了重要线索。

图5 白豆杉（P. chienii）TS 基因的功能鉴定

(a) 不同植物中TPS家族成员的系统发育分析。紫色星号表示白豆杉的TPS（PcTS1/2）。绿色圆点表示含有Class I（DDXXD/E）基序的TPS，红色圆点表示含有Class II（DXDD）基序的TPS，黄色圆点表示含有双功能基序（DDXXD/E + DXDD）的TPS。

(b) 阳性转基因烟草的鉴定，分别表达PcTS1和TwTS1。

(c) 对表达PcTS1和TwTS1的幼苗及对照组（CK）的六烷提取物进行GC–MS分析。时间11.857 分钟表示taxadiene的目标峰。

(d) 11.857分钟的化合物质谱图与taxadiene质谱完全匹配。

(e) 不同TPS蛋白中DXDD和DDXXD/E基序的多序列比对分析。

(f) 利用SWISS-MODEL程序基于3p5p.1.A模型对PcTS1进行结构建模。红色框放大显示PcTS1的生物活性中心。

(g) 来自被子植物（Class I）、被子植物（Class II）及其他裸子植物（双功能TPS）的典型TPS蛋白结构分析。

7、白豆杉（P. chienii）CYP超家族与紫杉烷类（taxusin）生物合成的调控

CYP超家族介导氧化反应，在植物次生代谢中起关键作用，其中CYP725类基因参与紫杉醇（Taxol）生物合成。该研究在白豆杉基因组中共鉴定到548个CYP基因，分属52个家族，其中62个基因属于CYP725家族。系统比较显示，红豆杉科CYP家族（包括CYP725、CYP728、CYP867和CYP98）显著扩增（图 6a），其中CYP725基因主要位于9号染色体（24个）和11号染色体（37个），提示CYP725通过串联重复实现大规模扩增（图 6b）。

白豆杉在MeJA处理24 h和48 h后，分别鉴定到3,338和4,191个差异表达基因（DEGs），其中CYP725亚家族及大多数紫杉烷类生物合成相关基因特异性上调（图6c–d）。LC-MS/MS分析显示，MeJ 处理的白豆杉嫩枝中taxusin含量分别比对照高4.7倍和4.4倍（图6e–f）。

在CYP725家族及紫杉烷类生物合成相关基因的启动子中，MeJA响应顺式作用元件G-box和G-box-like明显富集，高于所有CYP启动子平均水平（图6f），提示其可能驱动MeJA诱导的表达。整合基因组和转录组分析鉴定出78个MeJA响应的转录因子（TFs），在这些基因启动子中还鉴定到ABRE、G-box（bHLH结合）、MBE（MYB结合）和W-box（WRKY结合）等顺式作用元件（图6g），提示这些TFs可能参与紫杉烷类生物合成的转录调控。

图6 白豆杉（P. chienii）CYP家族分析。

(a) 白豆杉及另外10种代表性植物的CYP450基因数量热图。每个CYP450家族以一个方块表示，蓝色表示对应家族中基因数量。热图颜色刻度范围为0–100。

(b) 白豆杉9号染色体和11号染色体上CYP725亚家族基因的分布。颜色条显示不同染色体上CYP725基因的数量。

(c) MeJA处理下CYP450家族基因的表达模式。

(d) MeJA处理下紫杉烷类生物合成相关基因的表达水平。热图刻度范围为0–1000 FPKM。

(e) CK和MeJA处理样品中taxusin的质谱图。

(f) 白豆杉嫩枝在CK和MeJA处理（24 h和48 h）下taxusin的积累水平。每个数值为六个生物学重复的平均值±标准差。****P<0.0001，**P<0.01。

(g) CYP基因和CYP725基因启动子中两类已报道MeJA响应顺式作用元件（G-box: CACGTGG，G-box-like: AACGTG）在正链（‘+’）和负链（‘-’）方向上的平均数量统计。

总结

综上，白豆杉（Pseudotaxus chienii）通过缺失关键酶TBT导致紫杉醇生物合成在10-去乙酰巴卡亭III截断，中间产物taxusin大量积累；CYP725家族及紫杉烷类生物合成相关基因在MeJA处理下特异性上调，并富集响应顺式作用元件，反映基因组水平的转录调控与次生代谢调控网络相互作用。该研究整合基因组、转录组及代谢组数据，将白豆杉紫杉烷类生物合成通路重新定义为进化塑性与代谢流优化协同驱动的体系，为红豆杉科紫杉烷类代谢起源与演化提供了全景视角。

参考文献：

Wang M, et al. Analysis genome of Pseudotaxus chienii reveals insights into the origin and evolution of taxane biosynthesis. Nat Commun. 2025.