基于Nanopore平台测序的TAIL Iso-seq可以准确量化转录本的Poly（A）尾长度，同时分析可变剪接、融合基因、鉴定新异构体，精确定量转录本表达水平，深度解析Poly（A）尾在基因表达调控中的作用。

Q：Tail Iso-seq的取样建议？

Tail Iso-seq细胞总量≥ 1 X 107个起送，全长转录组植物组织送样量须达到至少0.5g，动物取新鲜组织，组织体积要小，尽量长宽高≤0.5cm ，所切组织块的大小可参考绿豆颗粒的大小，送样量须达到至少0.2g。血液样本通常建议送新鲜血样，哺乳动物全血：2.5-5ml；鱼类、禽类、两栖类全血：0.5-1.0ml 及以上。

Total RNA的送样要求：

Q：Tail Iso-seq能测到lncRNA的Poly(A)长度吗？

可以，如果lncRNA有Poly(A)尾，可以通过Tail Iso-seq技术进行Poly(A)尾长度检测。

Q：Tail Iso-seq能检测近远端Poly(A)位点使用吗？

可以通过Tail Iso-seq技术直接分析基因Poly(A)位点的近远端usage情况。

Q：想了解某个基因的Poly(A)长度在组间差异及其与基因表达量的关系，怎么做？

Tail Iso-seq能够检测转录本在各样本中的Poly(A)长度分析，因此可以分析组与组之间Poly(A)长度差异。进一步将Poly(A)长度与转录本的表达量进行关联分析即可以得到Poly(A)长度与转录本表达的调控关系。

案例解析 植物全长RNA图谱揭示了Poly（A）长度的组织特异性和进化保守性（Nature Plants，IF=17.352）

Poly（A）尾是真核生物mRNA的标志之一，在调节mRNA代谢和翻译中起重要作用。Poly（A）的长度受到Poly（A）聚合酶和去腺苷化酶的动态调控。然而目前植物mRNA Poly（A）尾信息的资源仍相对匮乏。

该研究选取拟南芥的7种不同组织，以及玉米、水稻、大豆的茎组织。共构建了20个FLEP-seq2文库，使用Nanopore MinlON芯片进行测序，建立了包含拟南芥7个不同组织以及水稻、玉米、大豆茎的带有Poly（A）信息的全长转录组数据库。数据库显示不同物种的Poly（A）长度分布非常相似，但也有一些差异：与拟南芥相比，水稻基有更多的带有极短Poly（A）尾的转录本。但同源基因的Poly（A）尾长在不同物种中相对保守，可能是自然选择的结果。该数据库能够在不同组织和不同物种的单基因水平对植物Poly（A）尾进行全基因组表征研究。
 

参考文献：

Jia J, et al. An atlas of plant full-length RNA reveals tissue-specific and monocots-dicots conserved regulation of Poly(A) tail length. Nature Plants, 2022

大多数真核 mRNA 的 3‘非翻译区域下游含有一个非模板化的 poly(A)尾，这个尾有助于 mRNA 的稳定和向细胞质内的运输。poly(A)尾长度会影响mRNA的翻译效率，因此，poly(A) 尾长度分析可解析 mRNA 降解和翻译的动态调控过程，也能够发现一些 RNA 裂解和加尾的未知特点。使用 Dorado对有效数据的 poly(A) 长度进行计算，获得转录本对应的 poly(A) 长度。

不同样本的 poly(A) 尾长的分布图

将 poly(A) 长度中位数与表达量关联起来，得到 poly(A) 长度与转录本表达量的关联结果。

样品 poly(A) 长度与表达量的分布图

在真核生物中50% ~ 80%的基因有多个poly(A)位点，这些基因通过选择不同poly(A)位点进行多聚腺苷酸化，进而形成多个不同的 mRNA异构体，这个现象称为可变多聚腺苷酸化(alternative poly(A)denylation, APA)。当APA发生在内含子区域或编码区时，不同poly(A)位点的使用可能会导致其编码的蛋白序列发生改变；当APA发生在基因的3’UTR区域，会产生不同3’UTR长度的mRNA异构体，而不同长度的3’UTR会影响RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)在mRNA 3’UTR区域的结合，进而影响mRNA的功能、稳定性、翻译以及亚细胞定位。

使用 Quantifypoly(A) 进行poly(A)位点的鉴定、聚类与注释。

PAT在基因各个区域分布图

基因的poly(A)位点数量分布如下图所示：

PAC数量分布图

3’UTR 长度变化统计如下图所示：

3’UTR长度变化的统计

3’UTR长度的变化与基因表达之间的关系结果展示如下：

3’UTR长度的变化与基因表达之间的关系

利用表达定量得到的转录本在各个样品中的表达量 reads count 数据，进行差异表达分析。差异表达分析的软件为 DESeq2 ，筛选阈值为 padj < 0.05 且 |log2FoldChange| > 1.0，鉴定的差异表达转录本数目。

差异表达转录本火山图

富集分析统计学方法一般使用超几何检验，找出差异基因/转录本相对于所有有注释的基因/转录本显著富集的 GO Term 或 KEGG Pathway，KEGG富集分析软件为 clusterProfiler，GO富集分析软件为topGO。

差异表达转录本 GO 富集分析 dotplot 图

差异表达转录本 PATHWAY 富集分析 barplot 图