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纳米孔平台Cell-free DNA测序研究思路详解
液体活检
液体活检被广泛应用于各种领域：无创产前检测已在全球范围内用于筛查胎儿染色体非整倍体；癌症液体活检已被用于选择靶向治疗和监测疾病进展；器官移植患者的液体活检已被用于监测移殖物功能障碍等。液体活检的第一个应用是基于对cfDNA中遗传标记的检测，如性别差异、遗传多态性或突变。cfDNA是细胞外游离DNA（cell-free DNA）的缩写，是指在血液、尿液等体液中存在的游离的DNA片段。这些DNA片段来自于细胞的凋亡或坏死过程中释放出来的细胞核DNA，也可以来自胎盘、肿瘤等组织。每个cfDNA片段都带有其来源细胞的分子特征，如DNA甲基化状态、末端碱基motif、片段长度等，这些特征对疾病诊断或许存在潜在意义。
cfDNA发生改变的因素
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疾病状态：某些疾病状态会导致cfDNA的数量和特征发生改变。例如，癌症患者体内的肿瘤细胞释放的cfDNA可能含有肿瘤相关的突变或异常，从而导致cfDNA的特征发生改变。
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炎症和感染：炎症和感染状态也会影响cfDNA的水平和特征。炎症过程中，受损细胞释放的cfDNA量会增加，而感染状态下，病原体释放的DNA也会出现在血液中。
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生理状态：个体的生理状态也可能影响cfDNA的水平和特征。例如，运动、饮食、怀孕、精神压力等因素都可能对cfDNA的释放和循环造成影响。
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年龄和性别：研究表明，cfDNA的水平和特征可能会随着年龄和性别的变化而发生改变。不同年龄段和性别的个体可能具有不同的cfDNA特征。
什么是ONT-cfDNA测序？
ONT-cfDNA测序就是基于ONT测序技术对cfDNA进行测序。ONT测序是指使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的测序技术对DNA或RNA进行测序。其测序技术基于纳米孔测序原理，通过测量DNA或RNA分子通过纳米孔时产生的电信号来确定其序列。ONT测序具有长读长、实时数据生成和直接测序样本等优点，被广泛应用于基因组学、转录组学和临床诊断等领域。
产品优势
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长读长，单Reads长度最高可达4 Mb以上；
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基于电信号识别，无复杂的光学成像系统，可直接测序；
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无偏倚测序，无PCR引入的GC偏好性；
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实时测序，随时读取随时分析；
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同时进行DNA甲基化分析。
研究案例一
2023年5月发表在Genome Medicine上的文章“Single-molecule methylation profiles of cell-free DNA in cancer with nanopore sequencing”开发了一种使用基于纳米孔的单分子测序来检测cfDNA甲基化的模型。用此模型对癌症患者的cfDNA甲基化水平进行定义，用来区分cfDNA片段是来自肿瘤还是免疫细胞，以便在治疗期间进行纵向监测。
技术平台：PromethION 24 28X
实验材料：20名结直肠癌患者和5名正常人的血液cfDNA
原文链接：https://link.springer.com/article/10.1186/s13073-023-01178-3
文章亮点：
（1）对cfDNA建库测序进行改良，将ONT-cfDNA的灵敏度提升了一个量级。
（2）对结直肠癌患者基于ONT-cfDNA测序进行不同患者间的对比及单个患者不同时间的对比，对结直肠癌患者的cfDNA特征进行分析并构建模型，并对单个患者的病程与cfDNA的变化进行了深入探索。
研究结果：
在优化反应条件，使ONT建库能够适配cfDNA较小的提取量后，对cfDNA直接进行测序，分析其甲基化（图1A），优化后的方式将ONT-cfDNA的灵敏度提升了一个量级（图1B）。测序后发现健康样本的cfDNA含量不超过2%，但癌症患者的cfDNA含量总体水平均值为7%，差异十分显著（图1D）；以250 bp作为阈值来区分单核小体与双核小体，结果发现癌症患者单核小体含量为健康样本的2倍（图1E、F）；接着计算了每个非零覆盖的CpG位点的平均全位点甲基化，然后过滤癌症患者和健康对照者之间基因水平甲基化的统计学显著差异，发现基因甲基化水平差异显著（图1G、H）。
图1 ONT-cfDNA测序
癌症患者的原发肿瘤组织和外周白细胞作为参考样品以及纵向血浆样品。然后利用参考样品的甲基化谱对来自cfDNA的甲基化数据进行分类（图2A）。接着用GP2D和健康供体衍生的核小体混合物来对分类程序进行验证（图2B）。将被分类为细胞系参考系的reads比例，作为实际混合比和测序深度的函数进行绘制（图2C）。对程序进行验证后绘制癌症患者cfDNA的纵向甲基化图谱（图2D）。
图2 单分子甲基化序列分类
作者对另外两名癌症转移患者进行了类似的分析：一名患者（P4822）患有转移性胰腺神经内分泌癌，接受了多种治疗，包括靶向治疗、放疗和肽受体放射性核素治疗（PRRT），持续时间超过1000天（图3A）。每次治疗后，治疗效果与肿瘤特异性reads数下降之间存在相关性，新转移的出现反映在肿瘤特异性甲基化变化的reads数增加上（图3B）。对于另一名患有转移性胆管癌的患者（P6527），对吉西他滨化疗产生明显的耐药性，但在双重化疗治疗下，症状减轻了（图3C）。在研究进行到100天时，能明显观察到疾病发展趋势，并通过肿瘤特异性reads计数和肿瘤特异性基因水平甲基化的变化得到证实（图3D）。患者在原发肿瘤和肝转移肿瘤的手术切除后，肿瘤特异性读数的立即下降。
图3 两例患者cfDNA其他恶性肿瘤患者来源cfDNA的纵向甲基化谱
研究案例二
2023年3月，发表在Epigenetics上的文章采用ONT测序技术在猪心肌梗死（MI）模型中发现肥胖相关甲基化差异区域（DMRs），并且通过比较cfDNA与gDNA之间的DMRs来对cfDNA进行溯源。该研究为后期将研究方法移植到人类上，将cfDNA与体细胞DNA的5mC进行比较，已确定病例的确切位置打下基础。
技术平台：MinION
实验材料：10头正常饮食的猪与7头高热量食物的猪在诱导MI后抽提的cfDNA
原文链接：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15592294.2023.2199374
文章亮点：
（1）牛津纳米孔测序可以揭示血清中微量无细胞DNA中与肥胖相关的甲基化模式的变化。
（2）PPARGC1B基因内含子区中的一个差异甲基化区域被发现与肥胖有关。
（3）无细胞DNA中的差异甲基化区域可以作为某些疾病和病理的早期风险标志物。
研究结果：
作者用17只成年雌性哥廷根迷你猪（Ellegaard Göttingen Minipigs A/S，Dalmose，Denmark）通过实验诱导MI，用来作为实验材料，用来研究肥胖对心肌功能的影响。（在本研究中，仅使用未经SGLT2i治疗的幼稚动物。）实验流程如图4所示。
图4 研究设计流程图
与瘦猪相比，肥胖猪的cfDNA DMR甲基化率为66.3%，非甲基化率33.7%（图5）。选择四个具有生物学相关性的cfDNA DMR通过MSP-PCR进行验证，并用它们最接近的基因进行标记：DMR-TUB（图6a）、DMR-PPARGC1B（图6b）、DMR-GAS6（图6c）和DMR-EVL（图6d）。
图5 cfDNA DMRs甲基化的LLR
图6 四个差异甲基化区域测序结果
对肥胖相关的cfDNA-DMR的转录起始位点进行的基因富集分析显示，17个GO途径和KEGG途径显著富集（FDR<0.05），其中包括10个生物过程、1个细胞成分、1个分子功能和五个KEGG途径。前三个生物学过程是参与炎症反应的细胞因子产生的正调控、细胞葡萄糖稳态和细胞投射组织的负调控。细胞成分和分子功能分别是浓缩核染色体和调控氨酰基tRNA连接酶活性。最主要的KEGG途径是脂肪细胞因子信号通路、胰高血糖素信号通路、花生四烯酸代谢、B细胞受体信号通路和肌醇磷酸代谢（图7）。
图7 从位于cfDNA DMRs附近或内部的转录起始位点发现与肥胖相关的GO和KEGG途径显著富集（FDR<0.05）。（绿色圆圈：生物过程；蓝色三角形：细胞成分；橙色正方形：KEGG通路；+：分子功能）
总 结
从上述文章分析发现，研究内容可以集中在三个方面：
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疾病诊断与病程监测；
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疾病标志物筛选；
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非侵入性疾病研究。
