英文标题：TENT5-mediated polyadenylation of mRNAs encoding secreted proteins is essential for gametogenesis in mice

发表时间：2024.5

发表期刊：Nature Communications

IF：14.9

通讯作者：Andrzej Dziembowski（International Institute of Molecular and Cell Biology, Warsaw, Poland）

TENT5介导的多聚腺苷酸化过程对小鼠生殖细胞的形成至关重要。本研究首次揭示了TENT5家族中的四种非典型聚腺苷酸聚合酶（TENT5A、TENT5B、TENT5C和TENT5D）在小鼠生殖细胞发育过程中发挥着不可或缺的作用。特别是，TENT5B和TENT5C在卵子形成中具有重要且部分冗余的功能，而TENT5C和TENT5D则参与了精子形成的不同阶段。通过纳米孔Direct RNA测序技术，鉴定出TENT5在卵巢和睾丸中的靶向mRNA，其可以编码多种分泌蛋白，参与调控生殖细胞的形成。研究结果表明TENT5在生殖细胞中可以对特定mRNA进行聚腺苷酸化，从而调控其稳定性和翻译效率，为理解生殖细胞中mRNA的复杂调控网络提供了新的视角。

1. TENT5家族poly(A)聚合酶影响生殖细胞形成

为了探究TENT5家族的细胞质poly(A)聚合酶在生殖中的作用，作者构建了一系列基因敲除小鼠模型。单独敲除TENT5家族每个成员对小鼠的发育和异型交配的出生比例没有影响（图1A），而会导致雄性和雌性小鼠出现部分或完全不育（图1B）。尽管Tent5a 的缺失与部分不育相关，但是雌雄性生殖细胞的形态和结构正常，其中卵巢能够产生健康的卵母细胞，并且分离的GV期卵母细胞能够在体外成熟至减数分裂II中期（图1C）。由此说明，Tent5c和Tent5d对精子形成至关重要，而Tent5b和Tent5c在卵子形成中发挥关键但冗余的作用，Tent5a并不与生殖细胞形成过程直接相关。

2. 缺少Tent5b和Tent5c导致卵子形成发生早期停滞和退化

Tent5b/c基因双敲除会导致雌性不育，而仅有Tent5b或Tent5c足以维持正常的生育能力，表明这两个基因在功能上存在冗余。相应地可以在Tent5c-GFP和Tent5b-GFP敲入雌性小鼠中观察到这两个基因在卵母细胞的GV阶段有高度表达（图2A）。

对不同周龄的敲除小鼠进行解剖染色及细胞计数可知Tent5b/c双敲除的卵母细胞出现与成年双敲除雌性相似的早期退化迹象（图2B、C）。切片染色证实Tent5b/c双敲除雌性小鼠没有成熟卵泡和黄体的存在，以及卵泡直径显著减小表明在早期窦状卵泡阶段的卵泡发育停滞（图2D、E）。此外，TUNEL试验也显示卵母细胞内部和周围颗粒细胞均出现明显凋亡（图2F）。以上从形态、生理及细胞水平综合说明Tent5b/c缺失会导致卵子形成的早期停滞和退化。

图2：缺少Tent5b和Tent5c导致卵子形成发生早期停滞和退化

3. Tent5b C端GFP蛋白的负面效应

在Tent5b编码蛋白TENT5B的C端添加GFP蛋白(TENT5B-GFP) 导致雌性不育，而在TENT5B的N端(GFP-TENT5B)或者TENT5C的C端(TENT5C-GFP)添加GFP蛋白，则无任何异常，并且TENT5B-GFP中GFP融合蛋白表达量明显较高（图3A、B）。通过不同的组合交配发现只有雌性携带C端GFP标签时，其生育能力显著降低，尤其是在纯合子中，这一影响更为明显（图3C）。进一步观察显示，尽管TENT5B-GFP雌性的卵细胞仍然可以存活并能进入到第二次减数分裂的MII阶段，但是与野生型的染色体聚集不同，杂合子中的染色体表现出明显分离（图3D、E）。MII阶段免疫荧光染色结果显示，约有1/4的卵细胞存在一定程度的染色体结构破坏，以及细胞质中存在大量看似空洞或液泡化的结构，这可能与纺锤体和染色体排列紊乱有关（图3F、G）。

图3：TENT5B C端GFP蛋白的显性效应

4. TENT5家族参与卵母细胞mRNA的多聚腺苷酸化

通过对野生型、Tent5 b/c双敲除、以及30日龄携带TENT5B-GFP的纯合和杂合雌性小鼠细胞进行Direct RNA测序及polyA长度分析，结果表明，双敲除对卵巢中整体mRNA的 poly(A)尾巴长度分布影响不大（图4A、B）。然而，polyA长度差异分析显示polyA显著缩短的mRNA可以编码参与卵子发生的关键蛋白，比如透明带糖蛋白3（ZP3）和生长分化因子3（GDF9），这一结果也在PCR poly(A)检测中得到验证（图4C、D）。对5周龄野生型和Tent5b/c 双敲除雌性卵母细胞进行二代转录组测序和分析，筛选出在卵母细胞高表达的mRNA，结合DRS数据分析发现Tent5b/c 双敲除中有37个mRNA的ployA尾缩短，而TENT5B-GFP中有48个mRNA的ployA延长，并且其中有20个属于共有的mRNA，进一步分析显著变化的mRNA的polyA长度分布，表明双敲除和TENT5B-GFP敲入导致相反效果（图4E~G）。免疫荧光染色结果显示在卵泡发育后期，GDF9的水平显著降低，而ZP3蛋白的水平也有所减少，这与卵泡在早期发育停滞的表型相符（图4H）。以上结果表明，Tent5b和Tent5c参与卵母细胞mRNA的多聚腺苷酸化。

图4：TENT5家族参与卵母细胞mRNA的多聚腺苷酸化

5. Tent5c和Tent5d影响精子形成过程

Tent5c和Tent5d敲除均会导致雄性不育。免疫荧光染色结果显示，Tent5c在3周和8周龄雄性生精小管腔附近精子细胞中表达较高，而Tent5d在年轻雄性睾丸组织早期减数分裂阶段表达较少，并在成年雄性中表达丧失（图5A）。Western blot和流式分选实验进一步证实Tent5c和Tent5d两种基因的表达模式与精子表型一致，Tent5c敲除会导致从附睾中分离的精子头部或DNA物质大量丢失（图5B），而Tent5d 敲除会使得睾丸由于严重的组织结构退化明显变小（图5C）。进一步分析发现Tent5c 敲除产生的生殖细胞数量少于野生型，并且可以导致生殖细胞减数分裂过程受阻，从而导致细胞数量在15周龄前保持稳定（图5D、E）。与Sertoli细胞（睾丸营养细胞）共培养能够显著提高生殖细胞的存活率，尤其是Tent5d敲除细胞（图5F）。Direct RNA测序分析发现敲除对整体poly(A)的长度分布影响较小，而年龄对此的影响更为显著（图5G），同时鉴定得到一些导致polyA显著缩短的mRNA(Tppp2、Insl3、Rnaset2)，这些mRNA在Tent5c和Tent5d敲除细胞中表达明显不同，但其编码蛋白表达水平也在不同阶段的精子细胞中均有所减少（图5H~N）。

图5：Tent5c和Tent5d影响精子形成过程

6. TENT5家族poly(A)聚合酶在生殖细胞形成中增强分泌蛋白的表达

对含有胞质polyA延伸因子CPEB1/2 motif的mRNA的poly(A)尾长度分布进行分析，结果显示TENT5的敲除未对这些mRNA的poly(A)尾长度分布产生显著影响（图6A）。GO富集分析显示，参与生殖和发育过程的基因占比最多，其中很大比例可以编码分泌蛋白（图6B），典型分泌蛋白内质网（ER）定位信号肽（SP）的发现证实了这一现象（图6C）。在睾丸和卵巢中，TENT5功能缺失对带有ER定位信号的mRNA的poly(A)尾巴长度的影响，比对其他mRNA的影响更为显著，表明带有ER定位信号的mRNA可能是TENT5的主要作用靶点（图6C）。荧光素酶报告基因实验分析发现，TENT5的敲除会导致编码SP的mRNA poly(A)化速率显著降低，表明在翻译起始时被招募到ER的那些转录本依赖于TENT5蛋白进行多聚腺苷酸化（图6D）。

图6：TENT5家族poly(A)聚合酶在生殖细胞形成中增强分泌蛋白的表达

图7：TENT5介导mRNA多聚腺苷酸化调控生殖细胞形成机制

参考文献：

Brouze M, Czarnocka-Cieciura A, Gewartowska O, et al. TENT5-mediated polyadenylation of mRNAs encoding secreted proteins is essential for gametogenesis in mice[J]. Nature Communications, 2024, 15(1): 5331.