英文标题：U6 snRNA m6A modification is required for accurate and efficient splicing of C. elegans and human pre-mRNAs

发表时间：2024.5

发表期刊：Nucleic Acids Research

IF：16.6

通讯作者：Alper Akay（School of Biological Sciences, University of East Anglia）

前体mRNA剪接是真核生物基因表达的一个关键特征。顺式剪接和反式剪接都依赖于剪接体U snRNA及其相关蛋白来准确识别剪接位点序列。剪接体snRNA携带多种RNA修饰，这些修饰可能影响前体mRNA剪接的不同阶段。其中U6 snRNA的m6A修饰在剪接过程中起着至关重要的作用。研究表明，U6 snRNA m6A甲基转移酶METTL16/METT-10在人类和小鼠中对U6 snRNA以及特定mRNA的甲基化至关重要。在秀丽隐杆线虫中，METT-10的缺失会导致广泛的剪接异常，影响数百个基因的剪接准确性和效率。

本研究通过Direct RNA测序（DRS）技术结合Illumina短读长测序，全面分析了秀丽隐杆线虫中METT-10缺失对RNA剪接的影响。研究发现，METT-10的缺失导致大量基因剪接位点的选择发生改变，尤其是对于含有+4A腺苷的5’剪接位点表现出高度敏感性，并且METT-10与剪接因子SNRP-27/SNRNP27K在调节5’剪接位点方面存在显著的协同作用。由此不仅阐明了METT-10在秀丽隐杆线虫前体mRNA剪接中的关键作用，还揭示了U6 snRNA m6A修饰在剪接位点的识别和选择中的重要作用，为理解RNA剪接机制和相关疾病的发生提供了新的视角。

1. METT-10功能的缺失导致顺式和反式剪接异常

mett-10(ok2204)纯合突变型（mett-10−/−）中完全缺失甲基转移酶结构域，并且缺少U6 snRNA m6A修饰，而重组的METT-10蛋白可以修饰体外转录的U6 snRNA。对野生型、mett-10−/−突变型和恢复型进行Direct RNA测序及Illumina测序，并分别进行顺式剪接和反式剪接的定量分析（图1A~D），结果显示在突变型与野生型之间，分别鉴定出多个差异顺式剪接事件和差异反式剪接事件（图1C~F）。其中有显著差异的顺式剪接事件类型主要为5’端可变剪接（A5SS）和3’端可变剪接（A3SS）（图1A、E），而有显著差异的反式剪接事件类型则主要为末端内含子保留和反式末端内含子保留事件（图1D、F）。由此说明METT-10功能的缺失可以导致广泛的剪接异常。

图1：METT-10功能的缺失导致顺式和反式剪接异常

2. 含有+4A腺苷的5’剪接位点(5' SS)对于METT-10缺失高度敏感

比较不同5’剪接位点的序列特征发现，大多数对METT-10缺失敏感的A5SS事件在+4A位点含有腺苷，并且位于//GURAG motif中，而在突变型中的A5SS事件并不富集于+4A位点（图2A）。进一步比较不同snRNA与剪接位点相互作用的序列特征，发现在METT-10缺失下，含有//GURAG motif且U5 snRNA相互作用较弱的5’剪接位点可以转变为不含//GURAG motif但具有更强U5相互作用序列的5’剪接位点（图2A）。以甲状腺激素受体相互作用因子TRIP3同源基因pch-2为例，在野生型中，外显子1的剪接主要发生在5’剪接位点 UU//GUGAG处，而在突变型中，剪接主要发生在上游3个核苷酸的AA//GUUGU位置（图2B），这一现象通过DRS数据得以验证（图2C）。然而，在突变型中，A5SS事件更倾向于发生在UG//GUUG序列的临近位置，并且75%的对METT-10缺失敏感的5’剪接位点含有+4A（图2D）。通过比较在每个位点上剪接事件ΔPSI值的分布，计算每个碱基对可变剪接的效应大小（图2E），发现含有+4A的5’剪接位点更有可能发生可变剪接（图2E）。此外，可变5’剪接位点同样可能位于典型剪接位点上下游5nt范围内（图2F）。总之，5’剪接位点上的+4A是使其对METT-10缺失敏感的关键特征，而在突变型中其剪接倾向于发生在不含+4A并且与上游外显子具有更强U5相互作用的序列。

图2：含有+4A腺苷的5’剪接位点(5' SS)对于METT-10缺失高度敏感

3. METT-10缺失导致内含子保留和外显子跳跃

通过鉴定可变剪接差异发现，存在显著差异的196个内含子保留事件中，有117个事件表现为增强，79个事件表现为减弱（图3A），并且在突变型中，内含子保留增强的5’剪接位点含有//GURAG motif和弱U5识别序列（图3A左），而内含子保留减弱的5’剪接位点具有AG//GU motif并且通常缺少+4A（图3A右）。例如，在人磷酸胞苷酰转移酶PCYT1同源基因Y18H1A.11中，其5’剪接位点的CA//GUGAG序列由//GURAG motif和一个弱U5相互作用的CA二核苷酸组成（图3B），在突变型中，表现出显著的内含子保留现象（图3B、D）。

随后比较突变型与野生型发生外显子跳跃的5’剪接位点序列（图3C），结果显示，外显子跳跃增强的位点具有一个//GURAG motif，并且这些位点含有+4A的概率更高，而减弱的位点则更有可能具有AG//GU motif（图3C）。例如，人水通道蛋白Aquaporin3同源基因aqp-2的外显子5在突变型中更容易发生外显子跳跃，这完全符合METT-10缺失时5’剪接位点的典型motif特征（图3E、F）。由此说明METT-10的缺失可以导致内含子保留和外显子跳跃事件，并且主要影响含有+4A的5’剪接位点。

图3：METT-10缺失导致内含子保留和外显子跳跃

4. METT-10缺失影响3'剪接位点(3' SS)的使用

METT-10缺失导致第二类显著的剪接事件是3’端可变剪接（A3SS）。在突变型中，可以观察到使用频率增加的3′剪接位点，含有强UUUCAG/R motif，此外可变3′剪接位点主要位于典型3′剪接位点的下游，并且大多数对METT-10缺失敏感的可变3′剪接位点会发生剪接位点的转换（图4A、B）。例如，在野生型中B0001.7基因的第6号内含子主要在下游3’剪接位点AUUCAG//G处进行剪接，而在突变型中，下游3’剪接位点的剪接频率明显下降，这一现象也在恢复型中得到了验证（图4C、D）。此外，与突变型中可变5’剪接位点的使用情况变化不同，可变3’剪接位点的使用模式发生了显著变化，即从野生型中较少使用的位点转移到较多使用的位点（图4E、F），并在突变型中可以观察到多个剪接事件中的位点使用上发生了完全反转（图4E、F）。

图4：METT-10缺失影响3'剪接位点(3' SS)的使用

5. 3′端反式剪接位点序列特征决定SL反式剪接对METT-10缺失的敏感性

在突变型中，同时还可以观察到明显的SL反式剪接现象，这种反式剪接可以将SL RNA 序列添加到前体mRNA的5’端，进而启动RNA剪接过程。DRS测序分析表明在突变型中，尽管数百个基因存在反式剪接异常，但在突变型中表达METT-10，可以恢复大多数反式剪接事件（图5A~D）。根据反式剪接差异对基因分类，并分析3'反式剪接位点的保守motif，结果显示，在突变型中存在反式剪接异常的基因含有弱3'反式剪接位点序列，并且不同ΔPSI的基因在同一位点的保守motif也有所不同（图5E）。由此表明，当METT-10缺失时，含有弱3'反式剪接位点的SL序列无法有效进行反式剪接。

图5：3′端反式剪接位点序列特征决定SL反式剪接对METT-10缺失的敏感性

6. 含有+4A的5’剪接位点对于METT-10和剪接因子SNRNP27K的缺失突变敏感

为了探究METT-10和剪接因子SNRP-27是否在秀丽隐杆线虫中影响相同5’剪接位点的剪接，作者重新分析了含有M141T突变的snrp-27(az26)突变型和相应的亲本系(CB936 unc-73(e936))的公开转录组数据，鉴定出更多的可变剪接事件，其中数量最多的类型为A5SS（图6A）。与METT-10突变型相似，SNRP-27的缺失突变也导致含有+4A和//GURAG motif的5’剪接位点的剪接减弱，并且更频繁地转换到含有AG//GU motif的可变5’剪接位点（图6B）。比较不同剪接位点每个碱基的效应大小，发现在snrp-27(az26)中含有+3G和+4A的5’剪接位点更有可能发生可变剪接（图6C）。此外同样也可以在野生型典型剪接位点上下游找到可变5’剪接位点，并且两种突变型中的5’剪接位点存在显著重叠（图6D）。而对于3'剪接位点，mett-10和snrp-27两种突变型的分布及其使用频率明显不同（图6E~G）。由此说明METT-10和SNRP-27可以影响含有+4A的5’剪接位点，并且它们之间可能存在协同效应。

图6：含有+4A的5’剪接位点对于METT-10和剪接因子SNRNP27K的缺失突变敏感

7. METTL16和THUMPD2在人类细胞中影响不同5’剪接位点的选择

重新分析人类METTL16敲低前后的细胞转录组数据，发现敲低METTL16也会导致数千个前体mRNA发生剪接异常。进一步分析对METTL16敏感的5’剪接位点的motif发现，这些位点显著富集了+4A，并且在+4位点上更可能是非A碱基（图7A）。这种+4A偏好的转变也可以在与U6相互作用的碱基序列频率中观察到，同时伴随着向更强U5相互作用碱基的转变。

分别比较由不同甲基化转移酶METTL16和THUMPD2调控的U6修饰的影响，发现U6 snRNA m6A43修饰位于与5’剪接位点碱基配对的UACAGA盒内，而m2G72修饰与剪接体催化中心的催化金属离子M1相互作用（图7B）。重新分析THUMPD2敲除前后的细胞转录组数据，结果发现THUMPD2的缺失同样会导致前体mRNA也出现大量异常，然而与METTL16不同，对THUMPD2敏感的5’剪接位点的序列并没有显示出+4A偏好，表明不同的RNA修饰在剪接体中具有不同的功能（图7C）。

例如，人磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸同源基因pipp-4P主要在两个可变5’剪接位点发生剪接，最常见的剪接发生在GU//GUAAG位点，而在突变型中，pipp-4P主要在第三个远端的5’剪接位点发生剪接，并且可能是其中一个Hpy166I限制位点发挥作用（图7D~E）。通过靶向CRISPR/Cas9将pipp-4P第4号内含子5’剪接位点中的+4A位点替换为+4U进行验证，结果表明这一替换可以将缺乏U6 snRNA m6A修饰的mett-10突变型恢复成野生型剪接模式（图7E~F）。

图7：METTL16和THUMPD2在人类细胞中影响不同5’剪接位点的选择

本研究揭示了真核生物前体mRNA剪接的关键机制，特别是U6 snRNA m6A修饰在剪接过程中重要性。通过深入分析METTL16/METT-10的功能，发现这些酶对mRNA和U6 snRNA的甲基化至关重要。在秀丽隐杆线虫中，METT-10的缺失可以导致广泛的剪接异常，特别是对5’剪接位点的+4A表现出高度敏感性，同时还揭示了METT-10与剪接因子SNRP-27K在剪接位点识别中的协同作用。该研究为理解RNA剪接的复杂性及其在疾病中的潜在角色提供了新的视角。

参考文献：

Shen A, Hencel K, Parker M T, et al. U6 snRNA m6A modification is required for accurate and efficient splicing of C. elegans and human pre-mRNAs [J]. Nucleic Acids Research, 2024: gkae447.