T2T基因组的发展带领基因组组装进入一个新的时代，在这个过程里，我们对基因组的组装有了更深刻和准确的认识——基因组的组装难度在于重复序列而非基因序列；所以，T2T组装的历程中，我们不断在克服和攻关的，大部分都是串联重复序列富集区域，例如：着丝粒区域，rDNA区域、端粒区域，甚至是这些结构的复合区域！

非常幸运的是，对于普通的基因组，ONT超长为我们打开了通往胜利的大门。N50>50K、100K、150K、200K。我们在挑战基因组提取和测序长度极限的同时，也组装出了一个个0gap，甚至是T2T基因组；2022年至今，不完全统计，我们已经参与了几百个T2T基因组项目；提供了超5000张超长芯片的测序服务；参与测序及组装，见刊的文章近20篇（IF>160），这些数字也让我们深感欣慰。 

IF=150+ | 贝纳基因王牌产品T2T基因组项目文章合集

但是，在这个过程中，也遇到很多复杂的，具有挑战的基因组，比如，黄瓜基因组，基因组虽小，却包含了大量的重复序列（DNA卫星、45S rDNA和TE序列等）。该基因组ONT超长N50>200K，测序深度达到94.97×，依然留下了一个gap未完成填补的遗憾！ 

ONT200K超长 项目文章｜黄瓜近完整参考基因组及多组学综合数据库

那么，除了用长读长序列跨越gap区域这个维度，是否还有另一个维度可以尝试解决T2T的问题呢？答案是，有——序列的互作关系！

我们在重复序列较多的复杂基因组的HIC图上，经常会看到互作信号不连续的空白区，往往在未挂载区域检测到没有互作信号，无法挂载到染色体区域的重复序列！对于HIC而言，一方面由于仅能检测两两互作，限制了每个reads可用于分析的接触点数量；同时，HIC具有二代测序数据的天然缺陷—GC偏好，使HIC可以完成挂载绝大部分区域的特性，但是又剥夺了其实现完美组装抵达T2T终点的能力！

而pore-c不同，Pore-C 将染色质构象捕获和长读长Nanopore测序相结合，天然地携带了Nanopore测序的一切优势：

前两个特点就为我们在T2T基因组组装上打开了突破口，至于特点三，未来可期……

为此，我们选取了富含重复序列的多倍体基因组做了HIC和Pore-c挂载的组装测试！

前情介绍：基因组大小2G（单套500M），HIC测序120G（60×）；pore-c测序60G（30×）；

见证奇迹的时刻：

1、  挂载到染色体区域的序列长度，pore-c结果比hic结果多了54M！Contig数量多了228条！

2、  228条contig，在HIC中互作信号杂乱无序，无法人工调整，甚至没有信号！而在pore-c中互作信号非常连续！

Pore-c互作热图细节展示

Hic互作热图细节展示

3、  检测以上contig信息，228条contig重复序列占比大于90%，注释信息显示，rDNA区域序列占比60%！

至此，我们看到富含重复序列的复杂基因组迎来了T2T组装的曙光，更多的复杂基因组可以跨入完整基因组的时代——T2T 2.0时代！

组装策略：

HiFi>n*50×+ ONT超长N50>100Kb（>n*50×）+ Pore-C(>n* 30×)+二代

Pore-c测序数据展示：

优秀的挂载需要足够的有效互作reads！通过对Pore-C实验流程的不断优化，贝纳基因已积累大量项目经验。目前，单cell产出最高超100G，已完成样本的平均单cell产出超80G；reads N50超7K，有效互作率（酶切后有效reads/Total reads）可达50%以上。

实测数据展示

灵山可能依然未到，但是取经路上的每一步，已经足够让人欣喜……